Pestisida memainkan peran penting dalam mengatasi kekurangan pangan global dan memerangi penyakit manusia yang ditularkan melalui vektor. Namun, masalah resistensi pestisida yang semakin meningkat sangat membutuhkan penemuan senyawa baru yang menargetkan target yang kurang dimanfaatkan. Saluran transient receptor potential (TRPV) serangga—Nanzhong (Nan) dan tidak aktif (Iav)—dapat membentuk saluran heterolog (Nan-Iav) dan terlokalisasi pada organ mekanosensori yang memediasi geotropisme, pendengaran, dan propriosepsi pada serangga. Beberapa pestisida, seperti aphidopyrrolidone (AP), menargetkan Nan-Iav melalui mekanisme yang belum diketahui. AP efektif melawan serangga pengisap (hemiptera), mencegah makan dengan mengganggu fungsi filamen. AP hanya dapat berikatan dengan Nan, tetapi hanya Nan-Iav yang dapat berinteraksi dengan agonis, termasuk nikotinamida endogen (NAM), sehingga menunjukkan aktivitas saluran. Meskipun Nan-Iav berpotensi sebagai target insektisida, sedikit yang diketahui tentang perakitan salurannya, situs pengikatan regulasi, dan regulasi yang bergantung pada Ca2+, sehingga menghambat pengembangan insektisida lebih lanjut. Dalam studi ini, mikroskopi krio-elektron digunakan untuk menentukan struktur Nan-Iav pada serangga Hemiptera dalam keadaan bebas ligan kalmodulin, serta dengan AP dan NAM pada batas domain sitoplasma pengulangan ankyrin (ARD). Secara mengejutkan, kami menemukan bahwa protein Nan itu sendiri dapat membentuk pentamer, yang distabilkan oleh interaksi ARD yang dimediasi AP. Studi ini mengungkapkan interaksi molekuler antara insektisida dan agonis dengan Nan-Iav, menyoroti pentingnya ARD dalam fungsi dan perakitan saluran, dan mengeksplorasi mekanisme regulasi Ca2+.
Di tengah semakin parahnya perubahan iklim global, memburuknya ketahanan pangan global merupakan salah satu tantangan utama abad ke-21, dengan konsekuensi berantai bagi masyarakat.1,2Laporan Kondisi Ketahanan Pangan dan Gizi di Dunia 2023 (SOFI) dari Organisasi Kesehatan Dunia memperkirakan bahwa sekitar 2,33 miliar orang di seluruh dunia menderita kerawanan pangan tingkat sedang hingga parah, sebuah masalah yang sudah berlangsung lama.3,4Sayangnya, diperkirakan 20% hingga 30% atau lebih dari hasil panen hilang setiap tahunnya akibat hama dan patogen, dan pemanasan global diperkirakan akan memperburuk resistensi hama dan kerentanan tanaman.4, 5, 6, 7, 8Pengembangan pestisida sangat penting tidak hanya untuk melindungi tanaman dari hama dan mengurangi penyebaran patogen yang ditularkan melalui vektor, tetapi juga untuk memerangi penyakit manusia yang ditularkan melalui vektor seperti demam berdarah, malaria, dan penyakit Chagas, yang semakin resisten terhadap pestisida.5, 9, 10, 11
Di antara target utama insektisida neurotoksik, saluran TRPV heterotetramerik Nanchung (Nan)-Inaktif (Iav) mewakili kelas target insektisida yang baru ditemukan dalam dekade terakhir, termasuk insektisida yang tersedia secara komersial seperti imidacloprid dan pyraclostrobin.12, 13, 14Insektisida semisintetik aphidopyrrolifen (AP) adalah produk yang baru dikembangkan dan dikomersialkan, yang komponen utamanya adalah insektisida aktif Inscalis®, yang mengikat AP pada tingkat aktivitas subnanomolar.15AP menunjukkan toksisitas akut yang rendah terhadap penyerbuk, serangga bermanfaat, dan organisme non-target lainnya, dan bila digunakan sesuai petunjuk label, dapat mengurangi tekanan resistensi terhadap insektisida lain.16, 17, 18Nan dan Iav tersebar luas di berbagai spesies serangga, diekspresikan bersamaan hanya pada neuron reseptor peregangan korda di antena dan anggota tubuh, dan sangat penting untuk pendengaran, persepsi gravitasi, dan propriosepsi.13, 16, 19, 20, 21, 22AP, imidacloprid, dan pyraclostrobin menstimulasi kompleks Nan-Iav melalui mekanisme unik, yang pada akhirnya menghambat transduksi sinyal proprioseptif.13, 16, 23Pada serangga pengisap (hemiptera) seperti kutu daun dan lalat putih, hilangnya propriosepsi mengganggu kemampuan mereka untuk makan, yang pada akhirnya menyebabkan kematian.13,24Menariknya, AP menunjukkan afinitas tinggi terhadap kompleks Nan-Iav dan afinitas rendah terhadap Nan saja. Pengikatan AP ke Nan-Iav menginduksi arus listrik, tetapi pengikatan ke Nan saja tidak menstimulasi aktivitas saluran. Iav sendiri sama sekali tidak berikatan dengan AP.16Hal ini menunjukkan bahwa Nan dan Iav mungkin berikatan membentuk kompleks saluran Nan-Iav yang berbeda (misalnya, dengan rasio stoikiometri yang berbeda atau susunan yang berbeda dalam rasio stoikiometri yang sama) atau bahwa AP mungkin berikatan dengan beberapa situs. Lebih lanjut, agonis alami nikotinamida (NAM) berikatan dengan Nan-Iav Drosophila dengan afinitas mikromolar, menunjukkan efek yang mirip dengan efek kutu daun (AP) secara in vitro.16,25serta menghambat reproduksi dan aktivitas makan kutu daun, yang pada akhirnya menyebabkan kematian mereka.25,26Data ini menimbulkan banyak pertanyaan. Misalnya, masih belum jelas bagaimana heterodimer Nan-Iav terbentuk, situs pengikatan mana yang digunakan untuk memodulasi molekul kecil, dan bagaimana molekul kecil ini mengatur fungsi saluran dengan menekan propriosepsi. Lebih lanjut, alasan mengapa Nan sendiri tidak aktif dan memiliki afinitas rendah terhadap AP, sementara heterodimer Nan-Iav aktif dan mengikat AP dengan afinitas yang lebih tinggi, masih belum jelas. Terakhir, sedikit yang diketahui tentang regulasi fungsi Nan-Iav yang bergantung pada Ca2+ dan bagaimana hal itu terintegrasi ke dalam proses pensinyalan neuron.13,21
Dalam penelitian ini, dengan menggabungkan mikroskopi krio-elektron, elektrofisiologi, dan teknik pengikatan radioligand, kami menguraikan perakitan Nan-Iav dan mekanisme pengikatannya terhadap regulator molekul kecil. Lebih lanjut, kami mendeteksi kalmodulin (CaM) yang terikat secara konstitutif pada pentamer Iav dan Nan yang distabilkan AP. Hasil ini memberikan wawasan penting tentang regulasi ion kalsium dalam saluran, perakitan saluran, dan faktor-faktor yang menentukan afinitas pengikatan ligan. Lebih penting lagi, kami mengkonfirmasi bahwa ARD memainkan peran sentral dalam proses ini. Studi kami tentang saluran serangga lengkap yang terikat pada pestisida pertanian yang relevan27, 28, 29membuka prospek bagi pengembangan industri pestisida, meningkatkan kemanjuran dan spesifisitas pestisida, serta memungkinkan penerapan senyawa yang ditargetkan pada TRPV ke spesies lain untuk mengatasi ketahanan pangan global dan penyebaran penyakit yang ditularkan melalui vektor.
Kami juga menemukan bahwa Nan-Iav diatur oleh Ca2+, dan mekanisme pengaturannya dimediasi oleh CaM yang terikat secara konstitutif. Yang penting, pengaturan Nav yang bergantung pada Ca2+ oleh CaM ini berbeda secara signifikan dari mekanisme pengaturan saluran ion lainnya (misalnya, saluran Na+ yang diatur tegangan dan saluran TRPV5/6).52, 53, 54, 55, 56, 57Pada kanal Nav1.2, domain C-terminal CaM berasosiasi secara heliks dengan domain C-terminal (CTD), dan Ca2+ menginduksi pengikatan domain N-terminalnya ke bagian distal CTD.56Pada saluran TRPV5/6, domain C-terminal CaM berikatan dengan CTH, dan Ca2+ menginduksi perpanjangan ke atas domain N-terminalnya ke dalam pori, sehingga menghalangi permeabilitas kation.53,54Kami mengusulkan sebuah model untuk fungsi Nan-Iav-CaM yang diatur oleh Ca2+ (Gambar 4h). Dalam model ini, domain N-terminal CaM secara konstitutif berikatan dengan domain C-terminal (CTH) Iav. Dalam keadaan istirahat (konsentrasi [Ca2+] rendah), domain C-terminal CaM berinteraksi dengan Nan, menstabilkan konformasi ARD dan dengan demikian mendorong pembukaan saluran. Pengikatan agonis/insektisida ke saluran menginduksi pembukaan pori, yang menyebabkan masuknya Ca2+. Ca2+ kemudian berikatan dengan CaM, menyebabkan disosiasi domain C-terminal dari ARD Nan. Karena pemblokiran pengikatan CaM pada dasarnya menghilangkan efek penghambatan Ca2+, disosiasi ini memodulasi mobilitas ARD, sehingga menyebabkan inhibisi atau desensitisasi yang bergantung pada Ca2+. Pemulihan cepat arus saluran setelah elusi ion kalsium (Gambar 4g) menunjukkan bahwa mekanisme ini memfasilitasi respons cepat terhadap sinyal neuronal yang dimediasi Ca2+. Selain itu, wilayah C-terminal Iav, yang masih kurang dipahami, dilaporkan memainkan peran lain dalam penargetan saluran dan regulasi arus.21
Akhirnya, penelitian kami menyajikan struktur resolusi tinggi dari kompleks saluran TRP insektisida-insektisida yang penting bagi pertanian—sebuah penemuan yang sebelumnya tidak kami ketahui. Yang penting, kami mengkarakterisasi struktur dan fungsi saluran serangga tersebut dalam sel manusia (HEK293S GnTi–) dan bukan dalam sel serangga. Dalam menghadapi meningkatnya resistensi insektisida dan tekanan berkelanjutan terhadap ketahanan pangan dan patogen, penelitian kami memberikan informasi penting yang akan memfasilitasi pengembangan insektisida baru untuk kepentingan kesehatan manusia dan ketahanan pangan global. Studi telah menunjukkan bahwa insektisida seperti AP efektif melawan beberapa hama bila digunakan sesuai petunjuk label dan memiliki toksisitas akut yang rendah terhadap penyerbuk yang bermanfaat, yang menunjukkan keamanannya bagi lingkungan.13,16Selain itu, pengujian beberapa turunan AP pada nyamuk telah menunjukkan bahwa mereka akhirnya kehilangan kemampuan untuk terbang. Memahami bagaimana senyawa modulator ini berikatan dengan Nan-Iav akan mempermudah modifikasi senyawa yang sudah ada atau pengembangan senyawa baru untuk efektivitas yang lebih baik.tepatPengendalian hama. Studi kami menunjukkan bahwa antarmuka Nan-Iav ARD sangat penting tidak hanya untuk mengatur aktivitas senyawa endogen, pestisida, dan Ca2+-CaM, tetapi juga untuk perakitan saluran. Kami menyarankan bahwa mengganggu perakitan heterodimer dengan molekul kecil mungkin merupakan pendekatan unik dan menjanjikan untuk mengembangkan penghambat saluran ion.
Dari delapan gen ortolog, gen lengkap kumbang cokelat (Halyomorpha halys) Nanchung dan Inactive dipilih, karena menunjukkan stabilitas yang sangat baik dalam deterjen. Gen yang disintesis dioptimalkan kodonnya untuk ekspresi manusia dan dikloning ke dalam vektor pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) menggunakan situs restriksi XhoI dan EcoRI. Hal ini memastikan bahwa klon berada dalam kerangka yang sama dengan tag GFP-FLAG-10xHis dan mCherry-FLAG-10xHis di ujung C-terminal, yang dipotong oleh protease HRC-3C (PPX), sehingga memungkinkan pemisahan independen.ekspresiPrimer yang digunakan untuk mengkloning Nanchung dan Inactive ke dalam vektor pBacMam adalah sebagai berikut:
Citra mikroskopis partikel individual diperoleh menggunakan mikroskop elektron transmisi Titan Krios G2 (FEI) yang dilengkapi dengan kamera K3 dan filter energi Gatan BioQuantum. Mikroskop dioperasikan pada 300 keV, dengan pengaturan energi 20 eV, ukuran piksel sampel 1,08 Å/piksel (perbesaran nominal 81.000x), dan gradien defokus berkisar dari -0,8 hingga -2,2 μm. Perekaman video dilakukan pada 40 frame per detik menggunakan mikroskop Latitude S (Gatan) dengan laju dosis nominal 25 e–px−1 s−1, waktu paparan 2,4 s, dan dosis total sekitar 60 e–Å−2.
Koreksi gerak akibat berkas sinar dan pembobotan dosis dilakukan pada film menggunakan MotionCor2 di RELION 4.061. Estimasi parameter fungsi transfer kontras (CTF) dilakukan di cryoSPARC menggunakan metode estimasi CTF berbasis patch62. Foto mikroskop dengan resolusi fitting CTF ≥4 Å dikecualikan dari analisis selanjutnya. Biasanya, subset 500–1000 foto mikroskop digunakan untuk pemilihan titik di cryoSPARC, diikuti oleh beberapa putaran klasifikasi 2D setelah penyaringan untuk mendapatkan gambar referensi yang jelas untuk pemilihan partikel berbasis templat. Partikel kemudian diekstrak menggunakan kotak pembatas 64 piksel dan binning 4 kali lipat. Beberapa putaran klasifikasi 2D dilakukan untuk menghilangkan kategori partikel yang tidak diinginkan. Model 3D awal direkonstruksi menggunakan rekonstruksi ab initio dan disempurnakan menggunakan penyempurnaan non-seragam di cryoSPARC. Klasifikasi 3D dilakukan di cryoSPARC atau RELION berdasarkan heterogenitas ARD. Tidak ditemukan heterogenitas domain membran yang signifikan. Partikel dimurnikan menggunakan metode C1 dan C2; partikel dengan resolusi C2 yang lebih tinggi dianggap simetris terhadap C2 dan diimpor ke RELION untuk pemurnian Bayesian. Partikel kemudian ditransfer kembali ke cryoSPARC untuk pemurnian nonuniform dan lokal akhir. Resolusi akhir dan jumlah partikel ditunjukkan pada Tabel 1.
Saat memproses pentamer Nan+AP, kami mengeksplorasi berbagai metode untuk meningkatkan resolusi domain membran (terutama wilayah pori), seperti pengurangan sinyal dan masking TMD. Namun, upaya ini tidak berhasil karena potensi gangguan ekstrem di wilayah pori dan heterogenitas keseluruhan TMD. Resolusi akhir dihitung menggunakan masker yang secara otomatis dihasilkan oleh metode pemrosesan non-seragam di cryoSPARC, terutama menargetkan wilayah ARD. Ini menghasilkan resolusi yang jauh lebih tinggi daripada domain membran (terutama wilayah VSLD).
Model de novo awal dari bentuk apo dari bakteri Nanchung dan Inactive pertama kali dihasilkan menggunakan Coot63, dan model dari bakteri Nan dan Iav dihasilkan menggunakan AlphaFold264 untuk mengidentifikasi wilayah dengan tingkat kepercayaan rendah. Pemodelan kalmodulin didasarkan pada penyesuaian rigid-body dari model pengikat Ca2+ dan model bebas Ca2+ dalam aksesi PDB 4JPZ56 dan 1CFD65, masing-masing. Model-model tersebut disempurnakan menggunakan penyempurnaan sferis untuk memastikan stereokimia yang benar dan geometri yang baik. Fosfatidilkolin, fosfatidiletanolamin, dan fosfatidilserin kemudian dimodelkan sebagai kerapatan lipid yang terdefinisi dengan baik, dan ligan NAM dan AP ditempatkan pada kerapatan yang sesuai di sambungan ketat. File batasan dihasilkan dari string SMILES dari isoform menggunakan eLBOW di PHENIX66. Akhirnya, model-model tersebut disempurnakan dalam ruang nyata di PHENIX menggunakan pencarian grid lokal dan minimisasi global dengan batasan struktur sekunder. Server MolProbity digunakan untuk penyempurnaan model dan analisis struktural, dan ilustrasi dilakukan menggunakan PyMOL dan UCSF Chimera X. 67,68,69 Analisis apertur dilakukan menggunakan server HOLE,70 dan pemetaan konservasi sekuens dilakukan menggunakan server Consurf.71
Analisis statistik dilakukan menggunakan Igor Pro 6.2, Excel Office 365, dan GraphPad Prism 7.0. Semua data kuantitatif disajikan sebagai mean ± kesalahan standar (SEM). Uji t Student (dua arah, tidak berpasangan) digunakan untuk membandingkan dua kelompok. Analisis varians satu arah (ANOVA) diikuti dengan uji post hoc Dunnett digunakan untuk membandingkan beberapa kelompok. *P< 0,05, **P< 0,01, dan ***PNilai < 0,001 dianggap signifikan secara statistik tergantung pada distribusi data. Nilai Kd, Ki, dan interval kepercayaan 95% asimetrisnya dihitung menggunakan GraphPad Prism 10.
Untuk detail lebih lanjut mengenai metodologi penelitian, silakan lihat Ringkasan Laporan Portofolio Nature yang ditautkan dalam artikel ini.
Model awal dibangun menggunakan model kalmodulin dari basis data PDB 4JPZ dan 1CFD. Koordinatnya telah disimpan di Protein Data Bank (PDB) dengan nomor akses 9NVN (Nan-Iav-CaM tanpa ligan), 9NVO (Nan-Iav-CaM terikat pada nikotinamida), 9NVP (Nan-Iav-CaM terikat pada nikotinamida dan EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM terikat pada afenidolpirrolin dan kalsium), 9NVR (Nan-Iav-CaM terikat pada afenidolpirrolin dan EDTA), dan 9NVS (Nan pentamer terikat pada afenidolpirrolin). Gambar mikroskopi krio-elektron yang terkait telah disimpan dalam Basis Data Mikroskop Elektron (EMDB) dengan nomor akses berikut: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM tanpa ligan), EMD-49845 (kompleks Nan-Iav-CaM dengan nikotinamida), EMD-49846 (kompleks Nan-Iav-CaM dengan nikotinamida dan EDTA), EMD-49847 (kompleks Nan-Iav-CaM dengan aphidopyrrolline dan kalsium), EMD-49848 (kompleks Nan-Iav-CaM dengan aphidopyrrolline dan EDTA), dan EMD-49849 (kompleks pentamer Nan dengan aphidopyrrolline). Data mentah untuk analisis fungsional disajikan dalam makalah ini.
Waktu posting: 28 Januari 2026