Obat antelmintik N,N-dietil-m-toluamida (DEETDEET (Dry Eye Acid) dilaporkan menghambat AChE (asetilkolinesterase) dan memiliki potensi sifat karsinogenik karena vaskularisasi yang berlebihan. Dalam makalah ini, kami menunjukkan bahwa DEET secara spesifik merangsang sel endotel yang mendorong angiogenesis, sehingga meningkatkan pertumbuhan tumor. DEET mengaktifkan proses seluler yang mengarah ke angiogenesis, termasuk proliferasi, migrasi, dan adhesi. Hal ini dikaitkan dengan peningkatan produksi NO dan ekspresi VEGF pada sel endotel. Pembisuan M3 atau penggunaan inhibitor M3 farmakologis menghilangkan semua efek ini, menunjukkan bahwa angiogenesis yang diinduksi DEET sensitif terhadap M3. Eksperimen yang melibatkan pensinyalan kalsium pada sel endotel dan HEK yang mengekspresikan reseptor M3 secara berlebihan, serta studi pengikatan dan penambatan, menunjukkan bahwa DEET bertindak sebagai modulator alosterik reseptor M3. Lebih lanjut, DEET menghambat AChE, sehingga meningkatkan ketersediaan asetilkolin dan pengikatannya ke reseptor M3, dan meningkatkan efek proangiogenik melalui regulasi alosterik.
Sel EC primer diisolasi dari aorta tikus Swiss. Metode ekstraksi diadaptasi dari protokol Kobayashi 26. Sel EC tikus dikultur dalam medium EBM-2 yang ditambah dengan 5% FBS yang diinaktivasi panas hingga passage keempat.
Pengaruh dua konsentrasi DEET terhadap proliferasi HUVEC, U87MG, atau BF16F10 dianalisis menggunakan Kit Uji Proliferasi Sel CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Secara singkat, 5 x 10³ sel per sumur ditanam dalam pelat 96 sumur, dibiarkan menempel semalaman, dan kemudian diberi perlakuan dengan DEET selama 24 jam. Setelah media pertumbuhan dihilangkan, tambahkan larutan pengikat pewarna ke setiap sumur mikroplate dan inkubasi sel pada suhu 37 °C selama 30 menit. Tingkat fluoresensi ditentukan menggunakan pembaca mikroplate multimode Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Jerman) yang dilengkapi dengan filter eksitasi 485 nm dan filter emisi 530 nm.
Sel HUVEC ditanam dalam pelat 96 sumur dengan kepadatan 104 sel per sumur. Sel-sel tersebut diberi perlakuan DEET selama 24 jam. Viabilitas sel dinilai menggunakan uji kolorimetri MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Nilai kerapatan optik diperoleh pada pembaca mikroplat multimode (Mithras LB940) pada panjang gelombang 570 nm.
Pengaruh DEET dipelajari menggunakan uji angiogenesis in vitro. Perlakuan dengan DEET 10⁻⁸ M atau 10⁻⁵ M meningkatkan pembentukan panjang kapiler pada HUVEC (Gambar 1a, b, batang putih). Dibandingkan dengan kelompok kontrol, perlakuan dengan konsentrasi DEET mulai dari 10⁻¹⁴ hingga 10⁻⁵ M menunjukkan bahwa panjang kapiler mencapai titik jenuh pada DEET 10⁻⁸ M (Gambar Tambahan S2). Tidak ditemukan perbedaan signifikan dalam efek proangiogenik in vitro HUVEC yang diberi perlakuan DEET dalam kisaran konsentrasi 10⁻⁸ M dan 10⁻⁵ M.
Untuk menentukan efek DEET pada neovaskularisasi, kami melakukan studi neovaskularisasi in vivo. Setelah 14 hari, tikus yang disuntik dengan sel endotel yang telah dikultur sebelumnya dengan 10-8 M atau 10-5 M DEET menunjukkan peningkatan kadar hemoglobin yang signifikan (Gambar 1c, batang putih).
Selanjutnya, neovaskularisasi yang diinduksi DEET dipelajari pada tikus pembawa xenograft U87MG yang disuntikkan setiap hari (ip) dengan DEET pada dosis yang diketahui menginduksi konsentrasi plasma 10-5 M, yang normal pada manusia yang terpapar. 23. Tumor yang terdeteksi (yaitu tumor >100 mm3) diamati 14 hari setelah penyuntikan sel U87MG ke dalam tikus. Pada hari ke-28, pertumbuhan tumor meningkat secara signifikan pada tikus yang diberi DEET dibandingkan dengan tikus kontrol (Gambar 1d, kotak). Selanjutnya, pewarnaan CD31 pada tumor menunjukkan bahwa DEET secara signifikan meningkatkan luas kapiler tetapi tidak meningkatkan kepadatan mikrovaskular. (Gambar 1e–g).
Untuk menentukan peran reseptor muskarinik dalam proliferasi yang diinduksi DETA, digunakan DETA 10-8 M atau 10-5 M dengan adanya pFHHSiD (10-7 M, antagonis reseptor M3 selektif). Perlakuan HUVEC dengan pFHHSiD sepenuhnya memblokir sifat proliferatif DETA pada semua konsentrasi (Tabel 1).
Dalam kondisi ini, kami juga memeriksa apakah DEET akan meningkatkan panjang kapiler pada sel HUVEC. Demikian pula, pFHHSiD secara signifikan mencegah peningkatan panjang kapiler yang diinduksi DEET (Gambar 1a, b, batang abu-abu). Selanjutnya, percobaan serupa dilakukan dengan siRNA M3. Meskipun siRNA kontrol tidak efektif dalam mendorong pembentukan kapiler, penonaktifan reseptor muskarinik M3 menghilangkan kemampuan DEET untuk meningkatkan panjang kapiler (Gambar 1a, b, batang hitam).
Selain itu, vaskularisasi yang diinduksi DEET 10-8 M atau 10-5 M secara in vitro dan neovaskularisasi secara in vivo sepenuhnya diblokir oleh pFHHSiD (Gambar 1c, d, lingkaran). Hasil ini menunjukkan bahwa DEET mendorong angiogenesis melalui jalur yang sensitif terhadap antagonis reseptor M3 selektif atau siRNA M3.
AChE merupakan target molekuler DEET. Obat-obatan seperti donepezil, yang bertindak sebagai penghambat AChE, dapat merangsang angiogenesis EC secara in vitro dan pada model iskemia tungkai belakang tikus14. Kami menguji efek dua konsentrasi DEET pada aktivitas enzim AChE di HUVEC. Konsentrasi DEET rendah (10-8 M) dan tinggi (10-5 M) menurunkan aktivitas AChE endotel dibandingkan dengan kondisi kontrol (Gambar 2).
Kedua konsentrasi DEET (10⁻⁸ M dan 10⁻⁵ M) mengurangi aktivitas asetilkolinesterase pada HUVEC. BW284c51 (10⁻⁵ M) digunakan sebagai kontrol untuk inhibitor asetilkolinesterase. Hasil dinyatakan sebagai persentase aktivitas AChE pada HUVEC yang diberi perlakuan dengan dua konsentrasi DEET dibandingkan dengan sel yang diberi perlakuan kendaraan. Nilai dinyatakan sebagai mean ± SEM dari enam percobaan independen. *p < 0,05 dibandingkan dengan kontrol (uji perbandingan berganda Kruskal-Wallis dan Dunn).
Nitric oxide (NO) terlibat dalam proses angiogenesis 33, oleh karena itu, produksi NO pada HUVEC yang distimulasi DEET dipelajari. Produksi NO endotel yang diobati dengan DEET meningkat dibandingkan dengan sel kontrol, tetapi hanya mencapai signifikansi pada dosis 10-8 M (Gambar 3c). Untuk menentukan perubahan molekuler yang mengontrol produksi NO yang diinduksi DEET, ekspresi dan aktivasi eNOS dianalisis dengan Western blotting. Meskipun pengobatan DEET tidak mengubah ekspresi eNOS, pengobatan ini secara signifikan meningkatkan fosforilasi eNOS pada situs aktivasinya (Ser-1177) sementara menurunkan situs penghambatnya (Thr-495) dibandingkan dengan sel yang tidak diobati dalam fosforilasi eNOS (Gambar 3d). Selanjutnya, rasio eNOS terfosforilasi pada situs aktivasi dan situs penghambat dihitung setelah menormalkan jumlah eNOS terfosforilasi terhadap jumlah total enzim. Rasio ini meningkat secara signifikan pada HUVEC yang diobati dengan setiap konsentrasi DEET dibandingkan dengan sel yang tidak diobati (Gambar 3d).
Terakhir, ekspresi VEGF, salah satu faktor proangiogenik utama, dianalisis dengan Western blotting. DEET secara signifikan meningkatkan ekspresi VEGF, sedangkan pFHHSiD sepenuhnya menghambat ekspresi ini.
Karena efek DEET sensitif terhadap blokade farmakologis dan penurunan regulasi reseptor M3, kami menguji hipotesis bahwa DEET mungkin meningkatkan sinyal kalsium. Secara mengejutkan, DEET gagal meningkatkan kalsium sitoplasma pada HUVEC (data tidak ditunjukkan) dan HEK/M3 (Gambar 4a, b) untuk kedua konsentrasi yang digunakan.
Waktu posting: 30 Desember 2024