Obat anthelmintik N,N-dietil-m-toluamida (DEET) telah dilaporkan menghambat AChE (asetilkolinesterase) dan memiliki potensi sifat karsinogenik karena vaskularisasi yang berlebihan. Dalam makalah ini, kami menunjukkan bahwa DEET secara spesifik merangsang sel endotel yang mendorong angiogenesis, sehingga meningkatkan pertumbuhan tumor. DEET mengaktifkan proses seluler yang mengarah pada angiogenesis, termasuk proliferasi, migrasi, dan adhesi. Hal ini terkait dengan peningkatan produksi NO dan ekspresi VEGF dalam sel endotel. Pembungkaman M3 atau penggunaan inhibitor M3 farmakologis menghapuskan semua efek ini, menunjukkan bahwa angiogenesis yang diinduksi DEET sensitif terhadap M3. Eksperimen yang melibatkan pensinyalan kalsium dalam sel endotel dan HEK yang mengekspresikan reseptor M3 secara berlebihan, serta studi pengikatan dan docking, menunjukkan bahwa DEET bertindak sebagai modulator alosterik reseptor M3. Lebih lanjut, DEET menghambat AChE, sehingga meningkatkan bioavailabilitas asetilkolin dan pengikatannya pada reseptor M3, dan meningkatkan efek proangiogenik melalui regulasi alosterik.
Sel EC primer diisolasi dari aorta tikus Swiss. Metode ekstraksi diadaptasi dari protokol Kobayashi 26 . Sel EC murine dikultur dalam medium EBM-2 yang disuplemen dengan 5% FBS yang diinaktivasi panas hingga pasase keempat.
Pengaruh dua konsentrasi DEET terhadap proliferasi HUVEC, U87MG, atau BF16F10 dianalisis menggunakan CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Singkatnya, 5,103 sel per sumur disemai dalam pelat 96 sumur, dibiarkan menempel semalaman, kemudian diberi perlakuan DEET selama 24 jam. Setelah media pertumbuhan dikeluarkan, tambahkan larutan pengikat pewarna ke setiap sumur pelat mikro dan inkubasi sel pada suhu 37°C selama 30 menit. Tingkat fluoresensi ditentukan menggunakan pembaca pelat mikro multimode Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Jerman) yang dilengkapi dengan filter eksitasi 485 nm dan filter emisi 530 nm.
HUVEC disemai dalam pelat 96 sumur dengan kepadatan 104 sel per sumur. Sel-sel tersebut diberi DEET selama 24 jam. Viabilitas sel dinilai menggunakan uji MTT kolorimetri (Sigma-Aldrich, M5655). Nilai kepadatan optik diperoleh menggunakan pembaca pelat mikro multimode (Mithras LB940) pada panjang gelombang 570 nm.
Efek DEET dipelajari menggunakan uji angiogenesis in vitro. Perlakuan dengan DEET 10-8 M atau 10-5 M meningkatkan pembentukan panjang kapiler pada HUVEC (Gambar 1a, b, batang putih). Dibandingkan dengan kelompok kontrol, perlakuan dengan konsentrasi DEET berkisar antara 10-14 hingga 10-5 M menunjukkan bahwa panjang kapiler mencapai plateau pada DEET 10-8 M (Gambar Tambahan S2). Tidak ditemukan perbedaan signifikan dalam efek proangiogenik in vitro HUVEC yang diberi DEET pada rentang konsentrasi 10-8 M dan 10-5 M.
Untuk menentukan efek DEET terhadap neovaskularisasi, kami melakukan studi neovaskularisasi in vivo. Setelah 14 hari, tikus yang disuntik dengan sel endotel yang telah dikultur sebelumnya dengan DEET 10-8 M atau 10-5 M menunjukkan peningkatan kadar hemoglobin yang signifikan (Gambar 1c, batang putih).
Lebih lanjut, neovaskularisasi yang diinduksi DEET dipelajari pada tikus xenograft U87MG yang disuntik setiap hari (ip) dengan DEET dengan dosis yang diketahui dapat menginduksi konsentrasi plasma 10⁻ ...
Untuk menentukan peran reseptor muskarinik dalam proliferasi yang diinduksi DETA, digunakan DETA 10-8 M atau 10-5 M dengan adanya pFHHSiD (10-7 M, antagonis reseptor M3 selektif). Pengobatan HUVEC. pFHHSiD sepenuhnya memblokir sifat proliferatif DETA pada semua konsentrasi (Tabel 1).
Dalam kondisi ini, kami juga menguji apakah DEET akan meningkatkan panjang kapiler pada sel HUVEC. Demikian pula, pFHHSiD secara signifikan mencegah panjang kapiler yang diinduksi DEET (Gambar 1a, b, batang abu-abu). Lebih lanjut, percobaan serupa dilakukan dengan siRNA M3. Meskipun siRNA kontrol tidak efektif dalam mendorong pembentukan kapiler, pembungkaman reseptor muskarinik M3 menghilangkan kemampuan DEET untuk meningkatkan panjang kapiler (Gambar 1a, b, batang hitam).
Lebih lanjut, vaskularisasi in vitro dan neovaskularisasi in vivo yang diinduksi DEET 10-8 M atau 10-5 M diblokir sepenuhnya oleh pFHHSiD (Gambar 1c, d, lingkaran). Hasil ini menunjukkan bahwa DEET mendorong angiogenesis melalui jalur yang sensitif terhadap antagonis reseptor M3 selektif atau siRNA M3.
AChE merupakan target molekuler DEET. Obat-obatan seperti donepezil, yang bertindak sebagai inhibitor AChE, dapat menstimulasi angiogenesis endotel in vitro dan pada model iskemia tungkai belakang tikus14. Kami menguji efek dua konsentrasi DEET terhadap aktivitas enzim AChE pada HUVEC. Konsentrasi DEET yang rendah (10-8 M) dan tinggi (10-5 M) menurunkan aktivitas AChE endotel dibandingkan dengan kondisi kontrol (Gbr. 2).
Kedua konsentrasi DEET (10-8 M dan 10-5 M) menurunkan aktivitas asetilkolinesterase pada HUVEC. BW284c51 (10-5 M) digunakan sebagai kontrol untuk inhibitor asetilkolinesterase. Hasil dinyatakan sebagai persentase aktivitas AChE pada HUVEC yang diberi dua konsentrasi DEET dibandingkan dengan sel yang diberi plasebo. Nilai dinyatakan sebagai rerata ± SEM dari enam percobaan independen. *p < 0,05 dibandingkan dengan kontrol (uji perbandingan berganda Kruskal-Wallis dan Dunn).
Nitric oxide (NO) terlibat dalam proses angiogenik 33, oleh karena itu, produksi NO dalam HUVEC yang distimulasi DEET dipelajari. Produksi NO endotel yang diobati dengan DEET meningkat dibandingkan dengan sel kontrol, tetapi mencapai signifikansi hanya pada dosis 10-8 M (Gbr. 3c). Untuk menentukan perubahan molekuler yang mengendalikan produksi NO yang diinduksi DEET, ekspresi dan aktivasi eNOS dianalisis dengan Western blotting. Meskipun pengobatan DEET tidak mengubah ekspresi eNOS, pengobatan DEET secara signifikan meningkatkan fosforilasi eNOS pada situs pengaktifannya (Ser-1177) sambil menurunkan situs penghambatannya (Thr-495) dibandingkan dengan sel yang tidak diobati dalam fosforilasi eNOS (Gbr. 3d). Lebih lanjut, rasio eNOS terfosforilasi pada situs aktivasi dan situs penghambatan dihitung setelah menormalkan jumlah eNOS terfosforilasi terhadap jumlah total enzim. Rasio ini meningkat secara signifikan pada HUVEC yang diobati dengan setiap konsentrasi DEET dibandingkan dengan sel yang tidak diobati (Gbr. 3d).
Akhirnya, ekspresi VEGF, salah satu faktor proangiogenik utama, dianalisis menggunakan Western blotting. DEET secara signifikan meningkatkan ekspresi VEGF, sementara pFHHSiD sepenuhnya memblokir ekspresi ini.
Karena efek DEET sensitif terhadap blokade farmakologis dan penurunan regulasi reseptor M3, kami menguji hipotesis bahwa DEET dapat meningkatkan pensinyalan kalsium. Yang mengejutkan, DEET gagal meningkatkan kalsium sitoplasma pada HUVEC (data tidak ditampilkan) dan HEK/M3 (Gambar 4a, b) untuk kedua konsentrasi yang digunakan.
Waktu posting: 30-Des-2024