Obat anthelmintik N,N-dietil-m-toluamida (DEET) telah dilaporkan menghambat AChE (asetilkolinesterase) dan memiliki potensi sifat karsinogenik karena vaskularisasi yang berlebihan. Dalam makalah ini, kami menunjukkan bahwa DEET secara khusus merangsang sel endotel yang meningkatkan angiogenesis, sehingga meningkatkan pertumbuhan tumor. DEET mengaktifkan proses seluler yang mengarah ke angiogenesis, termasuk proliferasi, migrasi, dan adhesi. Hal ini terkait dengan peningkatan produksi NO dan ekspresi VEGF dalam sel endotel. Pembungkaman M3 atau penggunaan inhibitor M3 farmakologis menghapuskan semua efek ini, yang menunjukkan bahwa angiogenesis yang diinduksi DEET peka terhadap M3. Eksperimen yang melibatkan pensinyalan kalsium dalam sel endotel dan HEK yang mengekspresikan reseptor M3 secara berlebihan, serta studi pengikatan dan docking, menunjukkan bahwa DEET bertindak sebagai modulator alosterik reseptor M3. Lebih jauh, DEET menghambat AChE, sehingga meningkatkan bioavailabilitas asetilkolin dan pengikatannya ke reseptor M3, dan meningkatkan efek proangiogenik melalui regulasi alosterik.
Sel EC primer diisolasi dari aorta tikus Swiss. Metode ekstraksi diadaptasi dari protokol Kobayashi 26 . Sel EC murine dikultur dalam medium EBM-2 yang ditambah dengan 5% FBS yang diinaktivasi panas hingga lintasan keempat.
Efek dari dua konsentrasi DEET pada proliferasi HUVEC, U87MG, atau BF16F10 dianalisis menggunakan CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Secara singkat, 5.103 sel per sumur disemai dalam pelat 96 sumur, dibiarkan menempel semalaman, dan kemudian diobati dengan DEET selama 24 jam. Setelah membuang media pertumbuhan, tambahkan larutan pengikat pewarna ke setiap sumur pelat mikro dan inkubasi sel pada suhu 37 °C selama 30 menit. Tingkat fluoresensi ditentukan menggunakan pembaca pelat mikro multimode Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Jerman) yang dilengkapi dengan filter eksitasi 485 nm dan filter emisi 530 nm.
HUVEC disemai dalam pelat 96-sumur dengan kepadatan 104 sel per sumur. Sel-sel diobati dengan DEET selama 24 jam. Viabilitas sel dinilai menggunakan uji MTT kolorimetrik (Sigma-Aldrich, M5655). Nilai kepadatan optik diperoleh pada pembaca mikroplat multimode (Mithras LB940) pada panjang gelombang 570 nm.
Efek DEET dipelajari menggunakan uji angiogenesis in vitro. Perlakuan dengan DEET 10-8 M atau 10-5 M meningkatkan pembentukan panjang kapiler pada HUVEC (Gbr. 1a, b, garis putih). Dibandingkan dengan kelompok kontrol, perlakuan dengan konsentrasi DEET berkisar antara 10-14 hingga 10-5 M menunjukkan bahwa panjang kapiler mencapai titik puncak pada DEET 10-8 M (Gambar Tambahan S2). Tidak ditemukan perbedaan signifikan dalam efek proangiogenik in vitro dari HUVEC yang diobati dengan DEET dalam kisaran konsentrasi 10-8 M dan 10-5 M.
Untuk menentukan efek DEET pada neovaskularisasi, kami melakukan studi neovaskularisasi in vivo. Setelah 14 hari, tikus yang disuntik dengan sel endotel yang dikultur sebelumnya dengan DEET 10-8 M atau 10-5 M menunjukkan peningkatan signifikan dalam kandungan hemoglobin (Gbr. 1c, batang putih).
Lebih jauh lagi, neovaskularisasi yang diinduksi DEET dipelajari pada tikus pembawa xenograft U87MG yang disuntik setiap hari (ip) dengan DEET pada dosis yang diketahui dapat menginduksi konsentrasi plasma sebesar 10-5 M, yang merupakan normal pada manusia yang terpapar. pada 23. Tumor yang dapat dideteksi (yaitu tumor >100 mm3) diamati 14 hari setelah penyuntikan sel U87MG ke tikus. Pada hari ke-28, pertumbuhan tumor meningkat secara signifikan pada tikus yang diobati dengan DEET dibandingkan dengan tikus kontrol (Gbr. 1d, kotak). Lebih jauh lagi, pewarnaan CD31 pada tumor menunjukkan bahwa DEET secara signifikan meningkatkan luas kapiler tetapi tidak kepadatan pembuluh darah mikro. (Gbr. 1e–g).
Untuk menentukan peran reseptor muskarinik dalam proliferasi yang diinduksi DETA, digunakan DETA 10-8 M atau 10-5 M dengan adanya pFHHSiD (10-7 M, antagonis reseptor M3 selektif). Pengobatan HUVEC. pFHHSiD sepenuhnya memblokir sifat proliferatif DETA pada semua konsentrasi (Tabel 1).
Dalam kondisi ini, kami juga memeriksa apakah DEET akan meningkatkan panjang kapiler dalam sel HUVEC. Demikian pula, pFHHSiD secara signifikan mencegah panjang kapiler yang diinduksi DEET (Gbr. 1a, b, batang abu-abu). Lebih jauh, percobaan serupa dilakukan dengan siRNA M3. Meskipun siRNA kontrol tidak efektif dalam mendorong pembentukan kapiler, pembungkaman reseptor muskarinik M3 menghilangkan kemampuan DEET untuk meningkatkan panjang kapiler (Gbr. 1a, b, batang hitam).
Lebih jauh lagi, vaskularisasi yang diinduksi DEET 10-8 M atau 10-5 M secara in vitro dan neovaskularisasi secara in vivo diblokir sepenuhnya oleh pFHHSiD (Gbr. 1c, d, lingkaran). Hasil ini menunjukkan bahwa DEET mendorong angiogenesis melalui jalur yang sensitif terhadap antagonis reseptor M3 selektif atau siRNA M3.
AChE adalah target molekuler DEET. Obat-obatan seperti donepezil, yang bertindak sebagai penghambat AChE, dapat merangsang angiogenesis EC secara in vitro dan pada model iskemia tungkai belakang tikus14. Kami menguji efek dua konsentrasi DEET pada aktivitas enzim AChE di HUVEC. Konsentrasi DEET yang rendah (10-8 M) dan tinggi (10-5 M) menurunkan aktivitas AChE endotel dibandingkan dengan kondisi kontrol (Gbr. 2).
Kedua konsentrasi DEET (10-8 M dan 10-5 M) mengurangi aktivitas asetilkolinesterase pada HUVEC. BW284c51 (10-5 M) digunakan sebagai kontrol untuk inhibitor asetilkolinesterase. Hasil dinyatakan sebagai persentase aktivitas AChE pada HUVEC yang diobati dengan dua konsentrasi DEET dibandingkan dengan sel yang diobati dengan pembawa. Nilai dinyatakan sebagai rata-rata ± SEM dari enam eksperimen independen. *p < 0,05 dibandingkan dengan kontrol (uji perbandingan ganda Kruskal-Wallis dan Dunn).
Nitric oxide (NO) terlibat dalam proses angiogenik 33, oleh karena itu, produksi NO dalam HUVEC yang terstimulasi DEET dipelajari. Produksi NO endotel yang diobati dengan DEET meningkat dibandingkan dengan sel kontrol, tetapi mencapai signifikansi hanya pada dosis 10-8 M (Gbr. 3c). Untuk menentukan perubahan molekuler yang mengendalikan produksi NO yang diinduksi DEET, ekspresi dan aktivasi eNOS dianalisis dengan Western blotting. Meskipun pengobatan DEET tidak mengubah ekspresi eNOS, pengobatan tersebut secara signifikan meningkatkan fosforilasi eNOS di situs pengaktifannya (Ser-1177) sambil menurunkan situs penghambatannya (Thr-495) dibandingkan dengan sel yang tidak diobati dalam fosforilasi eNOS (Gbr. 3d). Lebih jauh, rasio eNOS terfosforilasi di situs aktivasi dan situs penghambatan dihitung setelah menormalkan jumlah eNOS terfosforilasi dengan jumlah total enzim. Rasio ini meningkat secara signifikan pada HUVEC yang diobati dengan setiap konsentrasi DEET dibandingkan dengan sel yang tidak diobati (Gbr. 3d).
Terakhir, ekspresi VEGF, salah satu faktor proangiogenik utama, dianalisis dengan Western blotting. DEET secara signifikan meningkatkan ekspresi VEGF, sedangkan pFHHSiD sepenuhnya memblokir ekspresi ini.
Karena efek DEET sensitif terhadap blokade farmakologis dan penurunan regulasi reseptor M3, kami menguji hipotesis bahwa DEET dapat meningkatkan sinyal kalsium. Anehnya, DEET gagal meningkatkan kalsium sitoplasma dalam HUVEC (data tidak ditampilkan) dan HEK/M3 (Gbr. 4a, b) untuk kedua konsentrasi yang digunakan.
Waktu posting: 30-Des-2024