Pertumbuhan meristem apikal pucuk (SAM) sangat penting untuk arsitektur batang. Hormon tumbuhangiberelin(GA) memainkan peran kunci dalam mengoordinasikan pertumbuhan tanaman, tetapi peran mereka dalam SAM masih kurang dipahami. Di sini, kami mengembangkan biosensor rasiometrik pensinyalan GA dengan merekayasa protein DELLA untuk menekan fungsi regulasi esensialnya dalam respons transkripsi GA sambil mempertahankan degradasinya saat pengenalan GA. Kami menunjukkan bahwa biosensor berbasis degradasi ini secara akurat merekam perubahan kadar GA dan penginderaan seluler selama perkembangan. Kami menggunakan biosensor ini untuk memetakan aktivitas pensinyalan GA di SAM. Kami menunjukkan bahwa sinyal GA tinggi hadir terutama dalam sel-sel yang terletak di antara primordia organ, yang merupakan prekursor sel ruas. Dengan menggunakan pendekatan perolehan dan kehilangan fungsi, kami selanjutnya menunjukkan bahwa GA mengatur orientasi bidang pembelahan sel, membentuk organisasi seluler kanonik ruas, sehingga mendorong spesifikasi ruas di SAM.
Meristem apikal pucuk (SAM), yang terletak di puncak pucuk, mengandung relung sel punca yang aktivitasnya menghasilkan organ lateral dan nodus batang secara modular dan iteratif sepanjang hidup tanaman. Setiap unit berulang ini, atau nodus tanaman, mencakup ruas dan organ lateral pada nodus, serta meristem aksiler di ketiak daun. Pertumbuhan dan organisasi nodus tanaman berubah selama perkembangan. Pada Arabidopsis, pertumbuhan ruas terhambat selama tahap vegetatif, dan meristem aksiler tetap dorman di ketiak daun roset. Selama transisi ke fase bunga, SAM menjadi meristem inflorescence, menghasilkan ruas memanjang dan kuncup aksiler, ranting kecil di ketiak daun, dan kemudian, bunga tanpa daun. Meskipun kita telah membuat kemajuan signifikan dalam memahami mekanisme yang mengendalikan inisiasi daun, bunga, dan cabang, relatif sedikit yang diketahui tentang bagaimana ruas muncul.
Memahami distribusi spasiotemporal GA akan membantu untuk lebih memahami fungsi hormon-hormon ini di berbagai jaringan dan pada berbagai tahap perkembangan. Visualisasi degradasi fusi RGA-GFP yang diekspresikan di bawah aksi promotornya sendiri memberikan informasi penting tentang regulasi kadar GA total di akar15,16. Namun, ekspresi RGA bervariasi di seluruh jaringan17 dan diatur oleh GA18. Dengan demikian, ekspresi diferensial promotor RGA dapat menghasilkan pola fluoresensi yang diamati dengan RGA-GFP dan dengan demikian metode ini tidak kuantitatif. Baru-baru ini, GA19,20 berlabel fluorescein (Fl) bioaktif mengungkapkan akumulasi GA di endokorteks akar dan regulasi kadar selulernya oleh transpor GA. Baru-baru ini, sensor GA FRET nlsGPS1 menunjukkan bahwa kadar GA berkorelasi dengan pemanjangan sel di akar, filamen, dan hipokotil yang tumbuh gelap21. Namun, seperti yang telah kita lihat, konsentrasi GA bukanlah satu-satunya parameter yang mengendalikan aktivitas pensinyalan GA, karena bergantung pada proses penginderaan yang kompleks. Di sini, berdasarkan pemahaman kita tentang jalur pensinyalan DELLA dan GA, kami melaporkan pengembangan dan karakterisasi biosensor rasiometrik berbasis degradasi untuk pensinyalan GA. Untuk mengembangkan biosensor kuantitatif ini, kami menggunakan RGA mutan yang sensitif terhadap GA yang difusikan dengan protein fluoresen dan diekspresikan secara ubikuit dalam jaringan, serta protein fluoresen yang tidak sensitif terhadap GA. Kami menunjukkan bahwa fusi protein RGA mutan tidak mengganggu pensinyalan GA endogen ketika diekspresikan secara ubikuit, dan bahwa biosensor ini dapat mengkuantifikasi aktivitas pensinyalan yang dihasilkan dari masukan GA dan pemrosesan sinyal GA oleh aparatus penginderaan dengan resolusi spasiotemporal yang tinggi. Kami menggunakan biosensor ini untuk memetakan distribusi spasiotemporal aktivitas pensinyalan GA dan mengkuantifikasi bagaimana GA mengatur perilaku seluler dalam epidermis SAM. Kami menunjukkan bahwa GA mengatur orientasi bidang pembelahan sel SAM yang terletak di antara primordia organ, sehingga mendefinisikan organisasi seluler kanonik pada ruas.
Akhirnya, kami menanyakan apakah qmRGA dapat melaporkan perubahan kadar GA endogen menggunakan hipokotil yang sedang tumbuh. Kami sebelumnya menunjukkan bahwa nitrat merangsang pertumbuhan dengan meningkatkan sintesis GA dan, pada gilirannya, degradasi DELLA34. Dengan demikian, kami mengamati bahwa panjang hipokotil pada bibit pUBQ10::qmRGA yang tumbuh di bawah pasokan nitrat yang melimpah (10 mM NO3−) secara signifikan lebih panjang daripada bibit yang tumbuh dalam kondisi kekurangan nitrat (Gambar Tambahan 6a). Konsisten dengan respons pertumbuhan, sinyal GA lebih tinggi pada hipokotil bibit yang tumbuh di bawah kondisi 10 mM NO3− daripada bibit yang tumbuh tanpa nitrat (Gambar Tambahan 6b, c). Dengan demikian, qmRGA juga memungkinkan pemantauan perubahan dalam pensinyalan GA yang disebabkan oleh perubahan endogen dalam konsentrasi GA.
Untuk memahami apakah aktivitas pensinyalan GA yang dideteksi oleh qmRGA bergantung pada konsentrasi GA dan persepsi GA, seperti yang diharapkan berdasarkan desain sensor, kami menganalisis ekspresi ketiga reseptor GID1 dalam jaringan vegetatif dan reproduktif. Pada kecambah, galur reporter GID1-GUS menunjukkan bahwa GID1a dan c diekspresikan secara tinggi pada kotiledon (Gbr. 3a–c). Selain itu, ketiga reseptor diekspresikan pada daun, primordia akar lateral, ujung akar (kecuali tudung akar GID1b), dan sistem vaskular (Gbr. 3a–c). Pada SAM inflorescence, kami mendeteksi sinyal GUS hanya untuk GID1b dan 1c (Gambar Tambahan 7a–c). Hibridisasi in situ mengonfirmasi pola ekspresi ini dan selanjutnya menunjukkan bahwa GID1c diekspresikan secara seragam pada tingkat rendah di SAM, sedangkan GID1b menunjukkan ekspresi yang lebih tinggi di pinggiran SAM (Gambar Tambahan 7d–l). Fusi translasi pGID1b::2xmTQ2-GID1b juga mengungkapkan rentang ekspresi GID1b yang bertingkat, dari ekspresi rendah atau tidak ada di tengah SAM hingga ekspresi tinggi di batas organ (Gambar Tambahan 7m). Dengan demikian, reseptor GID1 tidak terdistribusi secara seragam di seluruh dan di dalam jaringan. Dalam percobaan selanjutnya, kami juga mengamati bahwa ekspresi berlebih GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) meningkatkan sensitivitas qmRGA di hipokotil terhadap aplikasi GA eksternal (Gambar 3d, e). Sebaliknya, fluoresensi yang diukur dengan qd17mRGA di hipokotil tidak sensitif terhadap perlakuan GA3 (Gambar 3f, g). Untuk kedua pengujian, bibit diperlakukan dengan konsentrasi tinggi GA (100 μM GA3) untuk menilai perilaku cepat sensor, di mana kemampuan untuk mengikat reseptor GID1 ditingkatkan atau hilang. Bersama-sama, hasil-hasil ini mengonfirmasi bahwa biosensor qmRGA menjalankan fungsi gabungan sebagai GA dan sensor GA, dan menunjukkan bahwa ekspresi diferensial reseptor GID1 dapat memodulasi emisivitas sensor secara signifikan.
Hingga saat ini, distribusi sinyal GA di SAM masih belum jelas. Oleh karena itu, kami menggunakan tanaman yang mengekspresikan qmRGA dan reporter sel induk pCLV3::mCherry-NLS35 untuk menghitung peta kuantitatif resolusi tinggi dari aktivitas pensinyalan GA, dengan fokus pada lapisan L1 (epidermis; Gambar 4a, b, lihat Metode dan Metode Tambahan), karena L1 memainkan peran kunci dalam mengendalikan pertumbuhan SAM36. Di sini, ekspresi pCLV3::mCherry-NLS memberikan titik referensi geometrik yang tetap untuk menganalisis distribusi spasiotemporal aktivitas pensinyalan GA37. Meskipun GA dianggap penting untuk perkembangan organ lateral4, kami mengamati bahwa sinyal GA rendah pada primordium bunga (P) mulai dari tahap P3 (Gambar 4a, b), sedangkan primordium P1 dan P2 muda memiliki aktivitas sedang yang serupa dengan yang ada di wilayah pusat (Gambar 4a, b). Aktivitas pensinyalan GA yang lebih tinggi terdeteksi pada batas primordium organ, dimulai pada P1/P2 (di sisi batas) dan memuncak pada P4, serta di semua sel di daerah perifer yang terletak di antara primordia (Gbr. 4a, b dan Gbr. Tambahan 8a, b). Aktivitas pensinyalan GA yang lebih tinggi ini diamati tidak hanya di epidermis tetapi juga di lapisan L2 dan L3 atas (Gbr. Tambahan 8b). Pola sinyal GA yang terdeteksi dalam SAM menggunakan qmRGA juga tetap tidak berubah seiring waktu (Gbr. Tambahan 8c–f, k). Meskipun konstruk qd17mRGA secara sistematis diturunkan regulasinya dalam SAM tanaman T3 dari lima galur independen yang kami karakterisasi secara rinci, kami dapat menganalisis pola fluoresensi yang diperoleh dengan konstruk pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Gbr. Tambahan 8g–j, l). Pada galur kontrol ini, hanya perubahan kecil dalam rasio fluoresensi yang terdeteksi di SAM, tetapi di pusat SAM kami mengamati penurunan VENUS yang jelas dan tak terduga terkait dengan TagBFP. Hal ini menegaskan bahwa pola pensinyalan yang diamati oleh qmRGA mencerminkan degradasi mRGA-VENUS yang bergantung pada GA, tetapi juga menunjukkan bahwa qmRGA mungkin melebih-lebihkan aktivitas pensinyalan GA di pusat meristem. Singkatnya, hasil kami mengungkapkan pola pensinyalan GA yang terutama mencerminkan distribusi primordia. Distribusi wilayah inter-primordial (IPR) ini disebabkan oleh pembentukan bertahap aktivitas pensinyalan GA yang tinggi antara primordium yang sedang berkembang dan wilayah pusat, sementara pada saat yang sama aktivitas pensinyalan GA di primordium menurun (Gbr. 4c, d).
Distribusi reseptor GID1b dan GID1c (lihat di atas) menunjukkan bahwa ekspresi diferensial reseptor GA membantu membentuk pola aktivitas pensinyalan GA di SAM. Kami bertanya-tanya apakah akumulasi diferensial GA mungkin terlibat. Untuk menyelidiki kemungkinan ini, kami menggunakan sensor nlsGPS1 GA FRET21. Peningkatan frekuensi aktivasi terdeteksi dalam SAM nlsGPS1 yang diobati dengan 10 μM GA4+7 selama 100 menit (Gambar Tambahan 9a-e), yang menunjukkan bahwa nlsGPS1 merespons perubahan konsentrasi GA di SAM, seperti halnya di akar21. Distribusi spasial frekuensi aktivasi nlsGPS1 mengungkapkan kadar GA yang relatif rendah di lapisan luar SAM, tetapi menunjukkan bahwa kadarnya meningkat di bagian tengah dan di tepi SAM (Gambar 4e dan Gambar Tambahan 9a,c). Hal ini menunjukkan bahwa GA juga terdistribusi di SAM dengan pola spasial yang sebanding dengan yang diungkapkan oleh qmRGA. Sebagai pendekatan komplementer, kami juga memperlakukan SAM dengan GA fluoresens (GA3-, GA4-, GA7-Fl) atau Fl sendiri sebagai kontrol negatif. Sinyal Fl didistribusikan ke seluruh SAM, termasuk daerah pusat dan primordium, meskipun pada intensitas yang lebih rendah (Gbr. 4j dan Gbr. Tambahan 10d). Sebaliknya, ketiga GA-Fl terakumulasi secara spesifik di dalam batas primordium dan pada tingkat yang bervariasi di sisa IPR, dengan GA7-Fl terakumulasi di domain terbesar di IPR (Gbr. 4k dan Gbr. Tambahan 10a,b). Kuantifikasi intensitas fluoresensi mengungkapkan bahwa rasio intensitas IPR terhadap non-IPR lebih tinggi pada SAM yang diobati dengan GA-Fl dibandingkan dengan SAM yang diobati dengan Fl (Gbr. 4l dan Gbr. Tambahan 10c). Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa GA hadir pada konsentrasi yang lebih tinggi dalam sel IPR yang terletak paling dekat dengan batas organ. Hal ini menunjukkan bahwa pola aktivitas pensinyalan GA SAM dihasilkan dari perbedaan ekspresi reseptor GA dan perbedaan akumulasi GA dalam sel IPR di dekat batas organ. Dengan demikian, analisis kami mengungkapkan pola spasiotemporal pensinyalan GA yang tidak terduga, dengan aktivitas yang lebih rendah di pusat dan primordium SAM dan aktivitas yang lebih tinggi pada IPR di daerah perifer.
Untuk memahami peran aktivitas pensinyalan GA diferensial dalam SAM, kami menganalisis korelasi antara aktivitas pensinyalan GA, ekspansi sel, dan pembelahan sel menggunakan pencitraan selang waktu nyata (real-time) dari SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Mengingat peran GA dalam regulasi pertumbuhan, korelasi positif dengan parameter ekspansi sel diharapkan. Oleh karena itu, pertama-tama kami membandingkan peta aktivitas pensinyalan GA dengan peta laju pertumbuhan permukaan sel (sebagai proksi untuk kekuatan ekspansi sel untuk sel tertentu dan untuk sel anak pada saat pembelahan) dan dengan peta anisotropi pertumbuhan, yang mengukur arah ekspansi sel (juga digunakan di sini untuk sel tertentu dan untuk sel anak pada saat pembelahan; Gambar 5a,b, lihat Metode dan Metode Tambahan). Peta laju pertumbuhan permukaan sel SAM kami konsisten dengan pengamatan sebelumnya38,39, dengan laju pertumbuhan minimal di perbatasan dan laju pertumbuhan maksimal pada bunga yang sedang berkembang (Gambar 5a). Analisis komponen utama (PCA) menunjukkan bahwa aktivitas pensinyalan GA berkorelasi negatif dengan intensitas pertumbuhan permukaan sel (Gambar 5c). Kami juga menunjukkan bahwa sumbu variasi utama, termasuk masukan sinyal GA dan intensitas pertumbuhan, ortogonal terhadap arah yang ditentukan oleh ekspresi CLV3 yang tinggi, yang mengonfirmasi pengecualian sel dari pusat SAM dalam analisis yang tersisa. Analisis korelasi Spearman mengonfirmasi hasil PCA (Gambar 5d), yang menunjukkan bahwa sinyal GA yang lebih tinggi pada IPR tidak menghasilkan ekspansi sel yang lebih tinggi. Namun, analisis korelasi menunjukkan korelasi positif yang sedikit antara aktivitas sinyal GA dan anisotropi pertumbuhan (Gambar 5c, d), yang menunjukkan bahwa sinyal GA yang lebih tinggi pada IPR memengaruhi arah pertumbuhan sel dan kemungkinan posisi bidang pembelahan sel.
a, b Peta panas pertumbuhan permukaan rata-rata (a) dan anisotropi pertumbuhan (b) dalam SAM yang dirata-ratakan pada tujuh tanaman independen (masing-masing digunakan sebagai proksi untuk kekuatan dan arah ekspansi sel). c Analisis PCA mencakup variabel-variabel berikut: sinyal GA, intensitas pertumbuhan permukaan, anisotropi pertumbuhan permukaan, dan ekspresi CLV3. Komponen PCA 1 terutama berkorelasi negatif dengan intensitas pertumbuhan permukaan dan berkorelasi positif dengan sinyal GA. Komponen PCA 2 terutama berkorelasi positif dengan anisotropi pertumbuhan permukaan dan berkorelasi negatif dengan ekspresi CLV3. Persentase mewakili variasi yang dijelaskan oleh setiap komponen. d Analisis korelasi Spearman antara sinyal GA, intensitas pertumbuhan permukaan, dan anisotropi pertumbuhan permukaan pada skala jaringan tidak termasuk CZ. Angka di sebelah kanan adalah nilai Spearman rho antara dua variabel. Tanda bintang menunjukkan kasus-kasus di mana korelasi/korelasi negatif sangat signifikan. e Visualisasi 3D sel L1 SAM Col-0 dengan mikroskopi konfokal. Dinding sel baru yang terbentuk di SAM (tetapi bukan primordium) pada jam ke-10 diwarnai sesuai nilai sudutnya. Bilah warna ditampilkan di pojok kanan bawah. Sisipan menunjukkan gambar 3D yang sesuai pada jam ke-0. Percobaan diulang dua kali dengan hasil yang serupa. f Plot kotak menampilkan laju pembelahan sel pada SAM IPR dan non-IPR Col-0 (n = 10 tanaman independen). Garis tengah menunjukkan median, dan batas kotak menunjukkan persentil ke-25 dan ke-75. Kumis menunjukkan nilai minimum dan maksimum yang ditentukan dengan perangkat lunak R. Nilai P diperoleh dengan uji-t dua sisi Welch. g, h Diagram skematik yang menunjukkan (g) cara mengukur sudut dinding sel baru (magenta) terhadap arah radial dari pusat SAM (garis putus-putus putih) (hanya nilai sudut lancip, yaitu 0–90°, yang dipertimbangkan), dan (h) arah keliling/lateral dan radial dalam meristem. i Histogram frekuensi orientasi bidang pembelahan sel melintasi SAM (biru tua), IPR (biru sedang), dan non-IPR (biru muda), berturut-turut. Nilai P diperoleh dengan uji Kolmogorov-Smirnov dua sisi. Percobaan diulang dua kali dengan hasil yang serupa. j Histogram frekuensi orientasi bidang pembelahan sel IPR di sekitar P3 (hijau muda), P4 (hijau sedang), dan P5 (hijau tua), berturut-turut. Nilai P diperoleh dengan uji Kolmogorov-Smirnov dua sisi. Percobaan diulang dua kali dengan hasil yang serupa.
Oleh karena itu, kami selanjutnya menyelidiki korelasi antara pensinyalan GA dan aktivitas pembelahan sel dengan mengidentifikasi dinding sel yang baru terbentuk selama pengujian (Gambar 5e). Pendekatan ini memungkinkan kami untuk mengukur frekuensi dan arah pembelahan sel. Yang mengejutkan, kami menemukan bahwa frekuensi pembelahan sel pada IPR dan bagian SAM lainnya (non-IPR, Gambar 5f) serupa, yang menunjukkan bahwa perbedaan pensinyalan GA antara sel IPR dan non-IPR tidak memengaruhi pembelahan sel secara signifikan. Hal ini, dan korelasi positif antara pensinyalan GA dan anisotropi pertumbuhan, mendorong kami untuk mempertimbangkan apakah aktivitas pensinyalan GA dapat memengaruhi orientasi bidang pembelahan sel. Kami mengukur orientasi dinding sel baru sebagai sudut lancip relatif terhadap sumbu radial yang menghubungkan pusat meristem dan pusat dinding sel baru (Gambar 5e-i) dan mengamati kecenderungan sel yang jelas untuk membelah pada sudut mendekati 90° relatif terhadap sumbu radial, dengan frekuensi tertinggi diamati pada 70–80° (23,28%) dan 80–90° (22,62%) (Gambar 5e,i), sesuai dengan pembelahan sel dalam arah melingkar/melintang (Gambar 5h). Untuk memeriksa kontribusi pensinyalan GA terhadap perilaku pembelahan sel ini, kami menganalisis parameter pembelahan sel pada IPR dan non-IPR secara terpisah (Gambar 5i). Kami mengamati bahwa distribusi sudut pembelahan pada sel IPR berbeda dari sel non-IPR atau sel di seluruh SAM, dengan sel IPR menunjukkan proporsi pembelahan sel lateral/sirkular yang lebih tinggi, yaitu 70–80° dan 80–90° (masing-masing 33,86% dan 30,71%, proporsi yang sesuai) (Gbr. 5i). Dengan demikian, pengamatan kami mengungkapkan hubungan antara pensinyalan GA yang tinggi dan orientasi bidang pembelahan sel yang dekat dengan arah keliling, serupa dengan korelasi antara aktivitas pensinyalan GA dan anisotropi pertumbuhan (Gbr. 5c, d). Untuk lebih lanjut menetapkan konservasi spasial dari hubungan ini, kami mengukur orientasi bidang pembelahan pada sel IPR di sekitar primordium mulai dari P3, karena aktivitas pensinyalan GA tertinggi terdeteksi di wilayah ini mulai dari P4 (Gbr. 4). Sudut pembelahan IPR di sekitar P3 dan P4 tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik, meskipun peningkatan frekuensi pembelahan sel lateral diamati pada IPR di sekitar P4 (Gambar 5j). Namun, pada sel IPR di sekitar P5, perbedaan orientasi bidang pembelahan sel menjadi signifikan secara statistik, dengan peningkatan tajam frekuensi pembelahan sel transversal (Gambar 5j). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa pensinyalan GA dapat mengendalikan orientasi pembelahan sel di SAM, yang konsisten dengan laporan sebelumnya40,41 bahwa pensinyalan GA yang tinggi dapat menginduksi orientasi lateral pembelahan sel di IPR.
Diprediksi bahwa sel-sel dalam IPR tidak akan tergabung ke dalam primordia, melainkan ke dalam ruas2,42,43. Orientasi transversal pembelahan sel dalam IPR dapat menghasilkan susunan khas barisan sel epidermis longitudinal paralel di dalam ruas. Pengamatan kami yang dijelaskan di atas menunjukkan bahwa pensinyalan GA kemungkinan berperan dalam proses ini dengan mengatur arah pembelahan sel.
Hilangnya fungsi beberapa gen DELLA menghasilkan respons GA konstitutif, dan mutan della dapat digunakan untuk menguji hipotesis ini44. Kami pertama-tama menganalisis pola ekspresi lima gen DELLA dalam SAM. Fusi transkripsional dari garis GUS45 mengungkapkan bahwa GAI, RGA, RGL1, dan RGL2 (pada tingkat yang jauh lebih rendah) diekspresikan dalam SAM (Gambar Tambahan 11a–d). Hibridisasi in situ selanjutnya menunjukkan bahwa mRNA GAI terakumulasi secara spesifik pada primordia dan bunga yang sedang berkembang (Gambar Tambahan 11e). mRNA RGL1 dan RGL3 terdeteksi di seluruh kanopi SAM dan pada bunga yang lebih tua, sedangkan mRNA RGL2 lebih melimpah di daerah perbatasan (Gambar Tambahan 11f–h). Pencitraan konfokal dari pRGL3::RGL3-GFP SAM mengonfirmasi ekspresi yang diamati oleh hibridisasi in situ dan menunjukkan bahwa protein RGL3 terakumulasi di bagian tengah SAM (Gambar Tambahan 11i). Dengan menggunakan galur pRGA::GFP-RGA, kami juga menemukan bahwa protein RGA terakumulasi di SAM, tetapi kelimpahannya menurun di perbatasan mulai dari P4 (Gambar Tambahan 11j). Khususnya, pola ekspresi RGL3 dan RGA konsisten dengan aktivitas pensinyalan GA yang lebih tinggi di IPR, sebagaimana dideteksi oleh qmRGA (Gambar 4). Lebih lanjut, data ini menunjukkan bahwa semua DELLA diekspresikan di SAM dan ekspresinya secara kolektif mencakup seluruh SAM.
Selanjutnya, kami menganalisis parameter pembelahan sel pada SAM tipe liar (Ler, kontrol) dan mutan gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) (Gbr. 6a, b). Menariknya, kami mengamati pergeseran yang signifikan secara statistik dalam distribusi frekuensi sudut pembelahan sel pada SAM mutan della global dibandingkan dengan tipe liar (Gbr. 6c). Perubahan pada mutan della global ini disebabkan oleh peningkatan frekuensi sudut 80–90° (34,71% vs. 24,55%) dan, pada tingkat yang lebih rendah, sudut 70–80° (23,78% vs. 20,18%), yaitu, yang berhubungan dengan pembelahan sel transversal (Gbr. 6c). Frekuensi pembelahan non-transversal (0–60°) juga lebih rendah pada mutan della global (Gbr. 6c). Frekuensi pembelahan sel transversal meningkat secara signifikan pada SAM mutan della global (Gambar 6b). Frekuensi pembelahan sel transversal pada IPR juga lebih tinggi pada mutan della global dibandingkan dengan tipe liar (Gambar 6d). Di luar wilayah IPR, tipe liar memiliki distribusi sudut pembelahan sel yang lebih seragam, sedangkan mutan della global lebih menyukai pembelahan tangensial seperti IPR (Gambar 6e). Kami juga mengkuantifikasi orientasi pembelahan sel pada SAM mutan kuintupel ga2 oksidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, dan ga2ox6-2), latar belakang mutan yang tidak aktif terhadap GA tempat GA terakumulasi. Sejalan dengan peningkatan kadar GA, SAM dari inflorescence mutan ga2ox quintuple lebih besar daripada Col-0 (Gambar Tambahan 12a, b), dan dibandingkan dengan Col-0, SAM ga2ox quintuple menunjukkan distribusi sudut pembelahan sel yang sangat berbeda, dengan frekuensi sudut meningkat dari 50° menjadi 90°, yang kembali mendukung pembelahan tangensial (Gambar Tambahan 12a–c). Dengan demikian, kami menunjukkan bahwa aktivasi konstitutif pensinyalan GA dan akumulasi GA menginduksi pembelahan sel lateral pada IPR dan seluruh SAM.
a, b Visualisasi 3D lapisan L1 dari Ler yang diwarnai PI (a) dan SAM mutan global della (b) menggunakan mikroskop konfokal. Dinding sel baru yang terbentuk di SAM (tetapi bukan primordium) selama periode 10 jam ditunjukkan dan diwarnai sesuai dengan nilai sudutnya. Sisipan menunjukkan SAM pada jam ke-0. Bilah warna ditampilkan di pojok kanan bawah. Panah pada (b) menunjukkan contoh berkas sel yang sejajar pada mutan global della. Percobaan diulang dua kali dengan hasil yang serupa. Perbandingan distribusi frekuensi orientasi bidang pembelahan sel di seluruh SAM (d), IPR (e), dan non-IPR (f) antara Ler dan global della. Nilai P diperoleh menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov dua sisi. f, g Visualisasi 3D citra konfokal SAM yang diwarnai PI dari tanaman transgenik Col-0 (i) dan pCUC2::gai-1-VENUS (j). Panel (a, b) menunjukkan dinding sel baru (tetapi bukan primordia) yang terbentuk di dalam SAM dalam waktu 10 jam. Percobaan diulang dua kali dengan hasil yang serupa. h–j Perbandingan distribusi frekuensi orientasi bidang pembelahan sel yang terletak di seluruh SAM (h), IPR (i), dan non-IPR (j) antara tanaman Col-0 dan pCUC2::gai-1-VENUS. Nilai P diperoleh menggunakan uji Kolmogorov–Smirnov dua sisi.
Selanjutnya, kami menguji efek penghambatan pensinyalan GA secara spesifik pada IPR. Untuk tujuan ini, kami menggunakan promotor cotyledon cup 2 (CUC2) untuk mendorong ekspresi protein gai-1 negatif dominan yang difusikan ke VENUS (pada galur pCUC2::gai-1-VENUS). Pada SAM tipe liar, promotor CUC2 mendorong ekspresi sebagian besar IPR pada SAM, termasuk sel border, mulai dari P4 dan seterusnya, dan ekspresi spesifik serupa diamati pada tanaman pCUC2::gai-1-VENUS (lihat di bawah). Distribusi sudut pembelahan sel pada SAM atau IPR tanaman pCUC2::gai-1-VENUS tidak berbeda secara signifikan dengan tipe liar, meskipun secara tak terduga kami menemukan bahwa sel tanpa IPR pada tanaman ini membelah pada frekuensi yang lebih tinggi, yaitu 80–90° (Gbr. 6f–j).
Telah disarankan bahwa arah pembelahan sel bergantung pada geometri SAM, khususnya tegangan tarik yang dihasilkan oleh kelengkungan jaringan46. Oleh karena itu, kami menanyakan apakah bentuk SAM diubah pada mutan della global dan tanaman pCUC2::gai-1-VENUS. Sebagaimana dilaporkan sebelumnya12, ukuran SAM mutan della global lebih besar daripada tipe liar (Gambar Tambahan 13a, b, d). Hibridisasi in situ CLV3 dan RNA STM mengonfirmasi ekspansi meristem pada mutan della dan selanjutnya menunjukkan ekspansi lateral niche sel punca (Gambar Tambahan 13e, f, h, i). Namun, kelengkungan SAM serupa pada kedua genotipe (Gambar Tambahan 13k, m, n, p). Kami mengamati peningkatan ukuran yang serupa pada mutan della quadruple gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 tanpa perubahan kelengkungan dibandingkan dengan tipe liar (Gambar Tambahan 13c, d, g, j, l, o, p). Frekuensi orientasi pembelahan sel juga terpengaruh pada mutan della quadruple, tetapi pada tingkat yang lebih rendah dibandingkan mutan della monolitik (Gambar Tambahan 12d–f). Efek dosis ini, bersama dengan tidak adanya efek pada kelengkungan, menunjukkan bahwa aktivitas RGL3 residual pada mutan Della quadruple membatasi perubahan orientasi pembelahan sel yang disebabkan oleh hilangnya aktivitas DELLA dan bahwa perubahan pembelahan sel lateral terjadi sebagai respons terhadap perubahan aktivitas pensinyalan GA, alih-alih perubahan geometri SAM. Sebagaimana dijelaskan di atas, promotor CUC2 mendorong ekspresi IPR dalam SAM dimulai pada P4 (Gambar Tambahan 14a, b), dan sebaliknya, SAM pCUC2::gai-1-VENUS memiliki ukuran yang lebih kecil tetapi kelengkungan yang lebih tinggi (Gambar Tambahan 14c–h). Perubahan morfologi SAM pCUC2::gai-1-VENUS ini dapat mengakibatkan distribusi tegangan mekanis yang berbeda dibandingkan dengan tipe liar, di mana tegangan sirkumferensial yang tinggi dimulai pada jarak yang lebih pendek dari pusat SAM47. Sebagai alternatif, perubahan morfologi SAM pCUC2::gai-1-VENUS dapat diakibatkan oleh perubahan sifat mekanis regional yang diinduksi oleh ekspresi transgen48. Dalam kedua kasus, hal ini sebagian dapat mengimbangi efek perubahan pensinyalan GA dengan meningkatkan kemungkinan sel akan membelah dalam orientasi sirkumferensial/transversal, yang menjelaskan pengamatan kami.
Secara keseluruhan, data kami mengonfirmasi bahwa pensinyalan GA yang lebih tinggi berperan aktif dalam orientasi lateral bidang pembelahan sel pada IPR. Data tersebut juga menunjukkan bahwa kelengkungan meristem juga memengaruhi orientasi bidang pembelahan sel pada IPR.
Orientasi transversal bidang pembelahan pada IPR, akibat aktivitas pensinyalan GA yang tinggi, menunjukkan bahwa GA melakukan pra-organisasi berkas sel radial pada epidermis di dalam SAM untuk menentukan organisasi seluler yang nantinya akan ditemukan di ruas epidermis. Bahkan, berkas sel tersebut sering terlihat pada citra SAM mutan della global (Gambar 6b). Oleh karena itu, untuk mengeksplorasi lebih lanjut fungsi perkembangan pola spasial pensinyalan GA pada SAM, kami menggunakan pencitraan selang waktu untuk menganalisis organisasi spasial sel pada IPR pada tanaman tipe liar (Ler dan Col-0), mutan della global, dan tanaman transgenik pCUC2::gai-1-VENUS.
Kami menemukan bahwa qmRGA menunjukkan bahwa aktivitas pensinyalan GA dalam IPR meningkat dari P1/P2 dan mencapai puncaknya pada P4, dan pola ini tetap konstan seiring waktu (Gbr. 4a–f dan Gbr. Tambahan 8c–f, k). Untuk menganalisis organisasi spasial sel dalam IPR dengan meningkatnya sinyal GA, kami memberi label sel IPR Ler di atas dan di samping P4 menurut nasib perkembangannya yang dianalisis 34 jam setelah pengamatan pertama, yaitu, lebih dari dua kali plastid, yang memungkinkan kami untuk mengikuti sel IPR selama perkembangan primordium dari P1/P2 hingga P4. Kami menggunakan tiga warna berbeda: kuning untuk sel-sel yang terintegrasi ke dalam primordium dekat P4, hijau untuk sel-sel yang berada di IPR, dan ungu untuk sel-sel yang berpartisipasi dalam kedua proses (Gbr. 7a–c). Pada t0 (0 jam), 1–2 lapisan sel IPR terlihat di depan P4 (Gbr. 7a). Sebagaimana diduga, ketika sel-sel ini membelah, pembelahannya terutama melalui bidang pembelahan transversal (Gambar 7a–c). Hasil serupa diperoleh menggunakan Col-0 SAM (berfokus pada P3, yang lipatan tepinya serupa dengan P4 pada Ler), meskipun pada genotipe ini lipatan yang terbentuk pada tepi bunga menyembunyikan sel-sel IPR lebih cepat (Gambar 7g–i). Dengan demikian, pola pembelahan sel-sel IPR mengorganisasikan sel-sel tersebut menjadi baris-baris radial, seperti pada ruas-ruas. Pengorganisasian baris-baris radial dan lokasi sel-sel IPR di antara organ-organ yang berurutan menunjukkan bahwa sel-sel ini merupakan progenitor ruas-ruas.
Di sini, kami mengembangkan biosensor sinyal GA rasiometrik, qmRGA, yang memungkinkan pemetaan kuantitatif aktivitas sinyal GA yang dihasilkan dari konsentrasi gabungan GA dan reseptor GA sambil meminimalkan gangguan dengan jalur sinyal endogen, sehingga memberikan informasi tentang fungsi GA pada tingkat sel. Untuk tujuan ini, kami membangun protein DELLA yang dimodifikasi, mRGA, yang telah kehilangan kemampuan untuk mengikat mitra interaksi DELLA tetapi tetap sensitif terhadap proteolisis yang diinduksi GA. qmRGA merespons perubahan eksogen dan endogen dalam kadar GA, dan sifat penginderaan dinamisnya memungkinkan penilaian perubahan spasiotemporal dalam aktivitas sinyal GA selama perkembangan. qmRGA juga merupakan alat yang sangat fleksibel karena dapat diadaptasi ke jaringan yang berbeda dengan mengubah promotor yang digunakan untuk ekspresinya (jika perlu), dan mengingat sifat jalur sinyal GA yang dilestarikan dan motif PFYRE di seluruh angiospermae, kemungkinan besar dapat ditransfer ke spesies lain22. Konsisten dengan ini, mutasi ekuivalen pada protein DELLA SLR1 padi (HYY497AAA) juga terbukti menekan aktivitas penekan pertumbuhan SLR1 sementara hanya sedikit mengurangi degradasi yang dimediasi GA, mirip dengan mRGA23. Khususnya, studi terbaru di Arabidopsis menunjukkan bahwa mutasi asam amino tunggal dalam domain PFYRE (S474L) mengubah aktivitas transkripsi RGA tanpa memengaruhi kemampuannya untuk berinteraksi dengan mitra faktor transkripsi50. Meskipun mutasi ini sangat dekat dengan 3 substitusi asam amino yang ada dalam mRGA, studi kami menunjukkan bahwa kedua mutasi ini mengubah karakteristik DELLA yang berbeda. Meskipun sebagian besar mitra faktor transkripsi mengikat domain LHR1 dan SAW dari DELLA26,51, beberapa asam amino yang dilestarikan dalam domain PFYRE dapat membantu menstabilkan interaksi ini.
Perkembangan ruas merupakan sifat kunci dalam arsitektur tanaman dan peningkatan hasil. qmRGA mengungkapkan aktivitas pensinyalan GA yang lebih tinggi pada sel progenitor ruas IPR. Dengan menggabungkan pencitraan kuantitatif dan genetika, kami menunjukkan bahwa pola pensinyalan GA menumpangkan bidang pembelahan sel melingkar/melintang pada epidermis SAM, membentuk organisasi pembelahan sel yang diperlukan untuk perkembangan ruas. Beberapa pengatur orientasi bidang pembelahan sel telah diidentifikasi selama perkembangan52,53. Pekerjaan kami memberikan contoh yang jelas tentang bagaimana aktivitas pensinyalan GA mengatur parameter seluler ini. DELLA dapat berinteraksi dengan kompleks protein pralipat41, sehingga pensinyalan GA dapat mengatur orientasi bidang pembelahan sel dengan secara langsung memengaruhi orientasi mikrotubulus kortikal40,41,54,55. Kami secara tak terduga menunjukkan bahwa pada SAM, korelasi aktivitas pensinyalan GA yang lebih tinggi bukanlah pemanjangan atau pembelahan sel, tetapi hanya anisotropi pertumbuhan, yang konsisten dengan efek langsung GA pada arah pembelahan sel di IPR. Namun, kita tidak dapat mengecualikan bahwa efek ini juga bisa tidak langsung, misalnya dimediasi oleh pelunakan dinding sel yang diinduksi GA56. Perubahan sifat dinding sel menginduksi stres mekanis57,58, yang juga dapat memengaruhi orientasi bidang pembelahan sel dengan memengaruhi orientasi mikrotubulus kortikal39,46,59. Efek gabungan dari stres mekanis yang diinduksi GA dan regulasi langsung orientasi mikrotubulus oleh GA mungkin terlibat dalam menghasilkan pola spesifik orientasi pembelahan sel di IPR untuk menentukan ruas, dan studi lebih lanjut diperlukan untuk menguji gagasan ini. Demikian pula, studi sebelumnya telah menyoroti pentingnya protein TCP14 dan 15 yang berinteraksi dengan DELLA dalam pengendalian pembentukan ruas60,61 dan faktor-faktor ini dapat memediasi aksi GA bersama dengan BREVIPEDICELLUS (BP) dan PENNYWISE (PNY), yang mengatur perkembangan ruas dan telah terbukti memengaruhi pensinyalan GA2,62. Mengingat bahwa DELLA berinteraksi dengan jalur pensinyalan brassinosteroid, etilen, asam jasmonat, dan asam absisat (ABA)63,64 dan bahwa hormon-hormon ini dapat memengaruhi orientasi mikrotubulus65, efek GA pada orientasi pembelahan sel juga dapat dimediasi oleh hormon-hormon lain.
Studi sitologi awal menunjukkan bahwa baik daerah dalam maupun luar SAM Arabidopsis diperlukan untuk perkembangan ruas2,42. Fakta bahwa GA secara aktif mengatur pembelahan sel di jaringan bagian dalam12 mendukung fungsi ganda GA dalam mengatur ukuran meristem dan ruas di SAM. Pola pembelahan sel terarah juga diatur secara ketat di jaringan SAM bagian dalam, dan pengaturan ini penting untuk pertumbuhan batang52. Akan menarik untuk mengkaji apakah GA juga berperan dalam mengorientasikan bidang pembelahan sel dalam organisasi SAM bagian dalam, sehingga menyinkronkan spesifikasi dan perkembangan ruas di dalam SAM.
Tanaman ditumbuhkan secara in vitro di dalam tanah atau media 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) yang disuplemen dengan 1% sukrosa dan 1% agar (Sigma) pada kondisi standar (cahaya 16 jam, 22 °C), kecuali untuk percobaan pertumbuhan hipokotil dan akar di mana bibit ditumbuhkan pada cawan vertikal di bawah cahaya konstan dan 22 °C. Untuk percobaan nitrat, tanaman ditumbuhkan pada media MS yang dimodifikasi (media tanaman bioWORLD) yang disuplemen dengan nitrat yang memadai (0 atau 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-suksinat, 1% sukrosa, dan 1% agar-A (Sigma) pada kondisi hari panjang.
cDNA GID1a yang disisipkan ke dalam pDONR221 direkombinasi dengan pDONR P4-P1R-pUBQ10 dan pDONR P2R-P3-mCherry ke dalam pB7m34GW untuk menghasilkan pUBQ10::GID1a-mCherry. DNA IDD2 yang disisipkan ke dalam pDONR221 direkombinasi dengan pB7RWG266 untuk menghasilkan p35S:IDD2-RFP. Untuk menghasilkan pGID1b::2xmTQ2-GID1b, fragmen sepanjang 3,9 kb di hulu wilayah pengkodean GID1b dan fragmen sepanjang 4,7 kb yang mengandung cDNA GID1b (1,3 kb) dan terminator (3,4 kb) pertama-tama diperkuat menggunakan primer dalam Tabel Tambahan 3, lalu disisipkan ke dalam pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) dan pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), masing-masing, dan akhirnya direkombinasi dengan pDONR221 2xmTQ268 ke dalam vektor target pGreen 012567 menggunakan kloning Gateway. Untuk menghasilkan pCUC2::LSSmOrange, urutan promotor CUC2 (3229 bp di hulu ATG) diikuti oleh urutan pengodean mOrange yang bergeser Stokes besar (LSSmOrange)69 dengan sinyal lokalisasi nukleus N7 dan terminator transkripsi NOS dirakit ke dalam vektor penargetan kanamisin pGreen menggunakan sistem rekombinasi 3-fragmen Gateway (Invitrogen). Vektor biner tanaman diintroduksi ke dalam galur Agrobacterium tumefaciens GV3101 dan diintroduksi ke dalam daun Nicotiana benthamiana dengan metode infiltrasi Agrobacterium dan ke dalam daun Arabidopsis thaliana Col-0 dengan metode celup bunga. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry dan pCLV3::mCherry-NLS qmRGA diisolasi dari progeni F3 dan F1 dari masing-masing persilangan.
Hibridisasi RNA in situ dilakukan pada ujung pucuk sepanjang kurang lebih 1 cm72, yang dikumpulkan dan segera difiksasi dalam larutan FAA (3,7% formaldehida, 5% asam asetat, 50% etanol) yang telah didinginkan terlebih dahulu hingga 4 °C. Setelah 2 x 15 menit vakum, fiksatif diganti dan sampel diinkubasi semalaman. cDNA GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, dan RGL3 serta probe antisense terhadap 3′-UTR-nya disintesis menggunakan primer yang ditunjukkan pada Tabel Tambahan 3 sebagaimana dijelaskan oleh Rosier dkk.73. Probe berlabel digoxigenin diimunodeteksi menggunakan antibodi digoxigenin (pengenceran 3000 kali lipat; Roche, nomor katalog: 11 093 274 910), dan potongan diwarnai dengan larutan 5-bromo-4-kloro-3-indolyl fosfat (BCIP, pengenceran 250 kali lipat)/nitroblue tetrazolium (NBT, pengenceran 200 kali lipat).
Waktu posting: 10 Februari 2025