Pertumbuhan meristem apikal pucuk (SAM) sangat penting untuk arsitektur batang. Hormon tumbuhangibberellin(GA) memainkan peran kunci dalam mengoordinasikan pertumbuhan tanaman, tetapi perannya dalam SAM masih kurang dipahami. Di sini, kami mengembangkan biosensor ratiometrik pensinyalan GA dengan merekayasa protein DELLA untuk menekan fungsi pengaturan esensialnya dalam respons transkripsi GA sambil mempertahankan degradasinya setelah pengenalan GA. Kami menunjukkan bahwa biosensor berbasis degradasi ini secara akurat mencatat perubahan kadar GA dan penginderaan seluler selama perkembangan. Kami menggunakan biosensor ini untuk memetakan aktivitas pensinyalan GA di SAM. Kami menunjukkan bahwa sinyal GA yang tinggi sebagian besar terdapat pada sel-sel yang terletak di antara primordia organ, yang merupakan prekursor sel internode. Menggunakan pendekatan gain-of-function dan loss-of-function, kami lebih lanjut menunjukkan bahwa GA mengatur orientasi bidang pembelahan sel, menetapkan organisasi seluler kanonik internode, sehingga mendorong spesifikasi internode di SAM.
Meristem apikal pucuk (SAM), yang terletak di ujung pucuk, mengandung ceruk sel punca yang aktivitasnya menghasilkan organ lateral dan nodus batang secara modular dan berulang sepanjang hidup tanaman. Setiap unit berulang ini, atau nodus tanaman, mencakup internodus dan organ lateral pada nodus, dan meristem aksiler di ketiak daun1. Pertumbuhan dan organisasi nodus tanaman berubah selama perkembangan. Pada Arabidopsis, pertumbuhan internodus ditekan selama tahap vegetatif, dan meristem aksiler tetap dorman di ketiak daun roset. Selama transisi ke fase berbunga, SAM menjadi meristem perbungaan, menghasilkan internodus memanjang dan tunas aksiler, cabang di ketiak daun batang, dan kemudian, bunga tanpa daun2. Meskipun kita telah membuat kemajuan signifikan dalam memahami mekanisme yang mengontrol inisiasi daun, bunga, dan cabang, relatif sedikit yang diketahui tentang bagaimana internodus muncul.
Memahami distribusi spasial dan temporal GA akan membantu untuk lebih memahami fungsi hormon ini di berbagai jaringan dan pada berbagai tahap perkembangan. Visualisasi degradasi fusi RGA-GFP yang diekspresikan di bawah aksi promotornya sendiri memberikan informasi penting tentang regulasi kadar GA total di akar15,16. Namun, ekspresi RGA bervariasi di berbagai jaringan17 dan diatur oleh GA18. Dengan demikian, ekspresi diferensial promotor RGA dapat menghasilkan pola fluoresensi yang diamati dengan RGA-GFP dan oleh karena itu metode ini tidak kuantitatif. Baru-baru ini, GA berlabel fluorescein (Fl) bioaktif19,20 mengungkapkan akumulasi GA di endokorteks akar dan regulasi kadar selulernya oleh transpor GA. Baru-baru ini, sensor FRET GA nlsGPS1 menunjukkan bahwa kadar GA berkorelasi dengan pemanjangan sel di akar, filamen, dan hipokotil yang tumbuh dalam gelap21. Namun, seperti yang telah kita lihat, konsentrasi GA bukanlah satu-satunya parameter yang mengontrol aktivitas pensinyalan GA, karena bergantung pada proses penginderaan yang kompleks. Di sini, berdasarkan pemahaman kita tentang jalur pensinyalan DELLA dan GA, kami melaporkan pengembangan dan karakterisasi biosensor ratiometrik berbasis degradasi untuk pensinyalan GA. Untuk mengembangkan biosensor kuantitatif ini, kami menggunakan RGA mutan yang sensitif terhadap GA yang digabungkan dengan protein fluoresen dan diekspresikan secara luas di jaringan, serta protein fluoresen yang tidak sensitif terhadap GA. Kami menunjukkan bahwa fusi protein RGA mutan tidak mengganggu pensinyalan GA endogen ketika diekspresikan secara luas, dan bahwa biosensor ini dapat mengukur aktivitas pensinyalan yang dihasilkan dari input GA dan pemrosesan sinyal GA oleh alat penginderaan dengan resolusi spasial dan temporal yang tinggi. Kami menggunakan biosensor ini untuk memetakan distribusi spasial dan temporal aktivitas pensinyalan GA dan mengukur bagaimana GA mengatur perilaku seluler di epidermis SAM. Kami menunjukkan bahwa GA mengatur orientasi bidang pembelahan sel SAM yang terletak di antara bakal organ, sehingga menentukan organisasi seluler kanonik dari ruas batang.
Terakhir, kami menanyakan apakah qmRGA dapat melaporkan perubahan kadar GA endogen menggunakan hipokotil yang sedang tumbuh. Sebelumnya kami menunjukkan bahwa nitrat merangsang pertumbuhan dengan meningkatkan sintesis GA dan, pada gilirannya, degradasi DELLA34. Dengan demikian, kami mengamati bahwa panjang hipokotil pada bibit pUBQ10::qmRGA yang tumbuh di bawah pasokan nitrat yang melimpah (10 mM NO3−) secara signifikan lebih panjang daripada bibit yang tumbuh di bawah kondisi kekurangan nitrat (Gambar Tambahan 6a). Konsisten dengan respons pertumbuhan, sinyal GA lebih tinggi pada hipokotil bibit yang tumbuh di bawah kondisi 10 mM NO3− daripada bibit yang tumbuh tanpa nitrat (Gambar Tambahan 6b, c). Dengan demikian, qmRGA juga memungkinkan pemantauan perubahan sinyal GA yang diinduksi oleh perubahan endogen dalam konsentrasi GA.
Untuk memahami apakah aktivitas pensinyalan GA yang terdeteksi oleh qmRGA bergantung pada konsentrasi GA dan persepsi GA, seperti yang diharapkan berdasarkan desain sensor, kami menganalisis ekspresi ketiga reseptor GID1 pada jaringan vegetatif dan reproduktif. Pada bibit, garis reporter GID1-GUS menunjukkan bahwa GID1a dan c diekspresikan secara tinggi di kotiledon (Gambar 3a–c). Selain itu, ketiga reseptor tersebut diekspresikan di daun, primordia akar lateral, ujung akar (kecuali tudung akar GID1b), dan sistem vaskular (Gambar 3a–c). Di SAM perbungaan, kami mendeteksi sinyal GUS hanya untuk GID1b dan 1c (Gambar Tambahan 7a–c). Hibridisasi in situ mengkonfirmasi pola ekspresi ini dan lebih lanjut menunjukkan bahwa GID1c diekspresikan secara seragam pada tingkat rendah di SAM, sedangkan GID1b menunjukkan ekspresi yang lebih tinggi di pinggiran SAM (Gambar Tambahan 7d–l). Fusi translasi pGID1b::2xmTQ2-GID1b juga mengungkapkan rentang ekspresi GID1b yang bertingkat, dari ekspresi rendah atau tidak ada di tengah SAM hingga ekspresi tinggi di perbatasan organ (Gambar Tambahan 7m). Dengan demikian, reseptor GID1 tidak terdistribusi secara seragam di seluruh dan di dalam jaringan. Dalam percobaan selanjutnya, kami juga mengamati bahwa ekspresi berlebih GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) meningkatkan sensitivitas qmRGA di hipokotil terhadap aplikasi GA eksternal (Gambar 3d, e). Sebaliknya, fluoresensi yang diukur oleh qd17mRGA di hipokotil tidak sensitif terhadap perlakuan GA3 (Gambar 3f, g). Untuk kedua pengujian, bibit diberi perlakuan dengan konsentrasi GA tinggi (100 μM GA3) untuk menilai perilaku cepat sensor, di mana kemampuan untuk mengikat reseptor GID1 ditingkatkan atau hilang. Secara keseluruhan, hasil ini menegaskan bahwa biosensor qmRGA memiliki fungsi gabungan sebagai sensor GA dan GA, dan menunjukkan bahwa ekspresi diferensial reseptor GID1 dapat secara signifikan memodulasi emisivitas sensor.
Sampai saat ini, distribusi sinyal GA di SAM masih belum jelas. Oleh karena itu, kami menggunakan tanaman yang mengekspresikan qmRGA dan reporter sel punca pCLV3::mCherry-NLS35 untuk menghitung peta kuantitatif resolusi tinggi dari aktivitas sinyal GA, dengan fokus pada lapisan L1 (epidermis; Gambar 4a, b, lihat Metode dan Metode Tambahan), karena L1 memainkan peran kunci dalam mengendalikan pertumbuhan SAM36. Di sini, ekspresi pCLV3::mCherry-NLS menyediakan titik referensi geometris tetap untuk menganalisis distribusi spasial dan temporal dari aktivitas sinyal GA37. Meskipun GA dianggap penting untuk perkembangan organ lateral4, kami mengamati bahwa sinyal GA rendah di primordium bunga (P) mulai dari tahap P3 (Gambar 4a, b), sedangkan primordium P1 dan P2 muda memiliki aktivitas sedang yang mirip dengan yang ada di wilayah tengah (Gambar 4a, b). Aktivitas sinyal GA yang lebih tinggi terdeteksi di batas primordium organ, dimulai pada P1/P2 (di sisi batas) dan mencapai puncaknya pada P4, serta di semua sel di wilayah perifer yang terletak di antara primordium (Gambar 4a, b dan Gambar Tambahan 8a, b). Aktivitas sinyal GA yang lebih tinggi ini diamati tidak hanya di epidermis tetapi juga di lapisan L2 dan L3 atas (Gambar Tambahan 8b). Pola sinyal GA yang terdeteksi di SAM menggunakan qmRGA juga tetap tidak berubah seiring waktu (Gambar Tambahan 8c–f, k). Meskipun konstruksi qd17mRGA secara sistematis mengalami penurunan regulasi di SAM tanaman T3 dari lima garis independen yang kami karakterisasi secara detail, kami dapat menganalisis pola fluoresensi yang diperoleh dengan konstruksi pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Gambar Tambahan 8g–j, l). Pada garis kontrol ini, hanya perubahan kecil pada rasio fluoresensi yang terdeteksi di SAM, tetapi di pusat SAM kami mengamati penurunan yang jelas dan tidak terduga pada VENUS yang terkait dengan TagBFP. Hal ini menegaskan bahwa pola pensinyalan yang diamati oleh qmRGA mencerminkan degradasi mRGA-VENUS yang bergantung pada GA, tetapi juga menunjukkan bahwa qmRGA mungkin melebih-lebihkan aktivitas pensinyalan GA di pusat meristem. Singkatnya, hasil kami mengungkapkan pola pensinyalan GA yang terutama mencerminkan distribusi primordia. Distribusi wilayah antar-primordia (IPR) ini disebabkan oleh pembentukan bertahap aktivitas pensinyalan GA yang tinggi antara primordia yang sedang berkembang dan wilayah pusat, sementara pada saat yang sama aktivitas pensinyalan GA di primordia menurun (Gambar 4c, d).
Distribusi reseptor GID1b dan GID1c (lihat di atas) menunjukkan bahwa ekspresi diferensial reseptor GA membantu membentuk pola aktivitas pensinyalan GA di SAM. Kami bertanya-tanya apakah akumulasi diferensial GA mungkin terlibat. Untuk menyelidiki kemungkinan ini, kami menggunakan sensor FRET GA nlsGPS121. Peningkatan frekuensi aktivasi terdeteksi di SAM nlsGPS1 yang diberi perlakuan 10 μM GA4+7 selama 100 menit (Gambar Tambahan 9a–e), menunjukkan bahwa nlsGPS1 merespons perubahan konsentrasi GA di SAM, seperti halnya di akar21. Distribusi spasial frekuensi aktivasi nlsGPS1 mengungkapkan kadar GA yang relatif rendah di lapisan luar SAM, tetapi menunjukkan bahwa kadarnya meningkat di bagian tengah dan di perbatasan SAM (Gambar 4e dan Gambar Tambahan 9a,c). Ini menunjukkan bahwa GA juga terdistribusi di SAM dengan pola spasial yang sebanding dengan yang diungkapkan oleh qmRGA. Sebagai pendekatan komplementer, kami juga memperlakukan SAM dengan GA fluoresen (GA3-, GA4-, GA7-Fl) atau Fl saja sebagai kontrol negatif. Sinyal Fl terdistribusi di seluruh SAM, termasuk wilayah tengah dan primordium, meskipun dengan intensitas yang lebih rendah (Gambar 4j dan Gambar Tambahan 10d). Sebaliknya, ketiga GA-Fl terakumulasi secara spesifik di dalam batas primordium dan pada berbagai tingkat di bagian IPR lainnya, dengan GA7-Fl terakumulasi di domain terbesar di IPR (Gambar 4k dan Gambar Tambahan 10a,b). Kuantifikasi intensitas fluoresensi menunjukkan bahwa rasio intensitas IPR terhadap non-IPR lebih tinggi pada SAM yang diberi perlakuan GA-Fl dibandingkan dengan SAM yang diberi perlakuan Fl (Gambar 4l dan Gambar Tambahan 10c). Secara bersamaan, hasil ini menunjukkan bahwa GA hadir dalam konsentrasi yang lebih tinggi di sel-sel IPR yang terletak paling dekat dengan batas organ. Hal ini menunjukkan bahwa pola aktivitas pensinyalan SAM GA dihasilkan dari ekspresi reseptor GA yang berbeda dan akumulasi GA yang berbeda di sel IPR di dekat batas organ. Dengan demikian, analisis kami mengungkapkan pola spasial dan temporal pensinyalan GA yang tidak terduga, dengan aktivitas yang lebih rendah di pusat dan primordium SAM dan aktivitas yang lebih tinggi di IPR di wilayah perifer.
Untuk memahami peran aktivitas sinyal GA diferensial di SAM, kami menganalisis korelasi antara aktivitas sinyal GA, ekspansi sel, dan pembelahan sel menggunakan pencitraan time-lapse real-time dari SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Mengingat peran GA dalam regulasi pertumbuhan, korelasi positif dengan parameter ekspansi sel diharapkan. Oleh karena itu, kami pertama-tama membandingkan peta aktivitas sinyal GA dengan peta laju pertumbuhan permukaan sel (sebagai proksi untuk kekuatan ekspansi sel untuk sel tertentu dan untuk sel anak pada pembelahan) dan dengan peta anisotropi pertumbuhan, yang mengukur arah ekspansi sel (juga digunakan di sini untuk sel tertentu dan untuk sel anak pada pembelahan; Gambar 5a,b, lihat Metode dan Metode Tambahan). Peta laju pertumbuhan permukaan sel SAM kami konsisten dengan pengamatan sebelumnya38,39, dengan laju pertumbuhan minimal di perbatasan dan laju pertumbuhan maksimal pada bunga yang sedang berkembang (Gambar 5a). Analisis komponen utama (PCA) menunjukkan bahwa aktivitas sinyal GA berkorelasi negatif dengan intensitas pertumbuhan permukaan sel (Gambar 5c). Kami juga menunjukkan bahwa sumbu utama variasi, termasuk input sinyal GA dan intensitas pertumbuhan, tegak lurus terhadap arah yang ditentukan oleh ekspresi CLV3 yang tinggi, yang mengkonfirmasi pengecualian sel dari pusat SAM dalam analisis selanjutnya. Analisis korelasi Spearman mengkonfirmasi hasil PCA (Gambar 5d), menunjukkan bahwa sinyal GA yang lebih tinggi di IPR tidak menghasilkan ekspansi sel yang lebih tinggi. Namun, analisis korelasi mengungkapkan sedikit korelasi positif antara aktivitas sinyal GA dan anisotropi pertumbuhan (Gambar 5c, d), menunjukkan bahwa sinyal GA yang lebih tinggi di IPR memengaruhi arah pertumbuhan sel dan mungkin posisi bidang pembelahan sel.
a, b Peta panas pertumbuhan permukaan rata-rata (a) dan anisotropi pertumbuhan (b) pada SAM yang dirata-ratakan pada tujuh tanaman independen (digunakan sebagai proksi untuk kekuatan dan arah ekspansi sel, masing-masing). c Analisis PCA mencakup variabel-variabel berikut: sinyal GA, intensitas pertumbuhan permukaan, anisotropi pertumbuhan permukaan, dan ekspresi CLV3. Komponen PCA 1 sebagian besar berkorelasi negatif dengan intensitas pertumbuhan permukaan dan berkorelasi positif dengan sinyal GA. Komponen PCA 2 sebagian besar berkorelasi positif dengan anisotropi pertumbuhan permukaan dan berkorelasi negatif dengan ekspresi CLV3. Persentase mewakili variasi yang dijelaskan oleh setiap komponen. d Analisis korelasi Spearman antara sinyal GA, intensitas pertumbuhan permukaan, dan anisotropi pertumbuhan permukaan pada skala jaringan tidak termasuk CZ. Angka di sebelah kanan adalah nilai rho Spearman antara dua variabel. Tanda bintang menunjukkan kasus di mana korelasi/korelasi negatif sangat signifikan. e Visualisasi 3D sel L1 SAM Col-0 dengan mikroskopi konfokal. Dinding sel baru yang terbentuk di SAM (tetapi bukan di primordium) pada 10 jam diwarnai sesuai dengan nilai sudutnya. Bilah warna ditampilkan di sudut kanan bawah. Sisipan menunjukkan gambar 3D yang sesuai pada 0 jam. Percobaan diulang dua kali dengan hasil yang serupa. f Plot kotak menampilkan laju pembelahan sel di SAM Col-0 IPR dan non-IPR (n = 10 tanaman independen). Garis tengah menunjukkan median, dan batas kotak menunjukkan persentil ke-25 dan ke-75. Garis vertikal menunjukkan nilai minimum dan maksimum yang ditentukan dengan perangkat lunak R. Nilai P diperoleh dengan uji t dua sisi Welch. g, h Diagram skematik yang menunjukkan (g) cara mengukur sudut dinding sel baru (magenta) terhadap arah radial dari pusat SAM (garis putus-putus putih) (hanya nilai sudut lancip, yaitu 0–90°, yang dipertimbangkan), dan (h) arah sirkumferensial/lateral dan radial di dalam meristem. i Histogram frekuensi orientasi bidang pembelahan sel di sepanjang SAM (biru tua), IPR (biru sedang), dan non-IPR (biru muda), masing-masing. Nilai P diperoleh dengan uji Kolmogorov-Smirnov dua arah. Percobaan diulang dua kali dengan hasil yang serupa. j Histogram frekuensi orientasi bidang pembelahan sel IPR di sekitar P3 (hijau muda), P4 (hijau sedang), dan P5 (hijau tua), masing-masing. Nilai P diperoleh dengan uji Kolmogorov-Smirnov dua arah. Percobaan diulang dua kali dengan hasil yang serupa.
Oleh karena itu, selanjutnya kami menyelidiki korelasi antara pensinyalan GA dan aktivitas pembelahan sel dengan mengidentifikasi dinding sel yang baru terbentuk selama pengujian (Gambar 5e). Pendekatan ini memungkinkan kami untuk mengukur frekuensi dan arah pembelahan sel. Secara mengejutkan, kami menemukan bahwa frekuensi pembelahan sel di IPR dan bagian SAM lainnya (non-IPR, Gambar 5f) serupa, menunjukkan bahwa perbedaan pensinyalan GA antara sel IPR dan non-IPR tidak secara signifikan memengaruhi pembelahan sel. Hal ini, dan korelasi positif antara pensinyalan GA dan anisotropi pertumbuhan, mendorong kami untuk mempertimbangkan apakah aktivitas pensinyalan GA dapat memengaruhi orientasi bidang pembelahan sel. Kami mengukur orientasi dinding sel baru sebagai sudut lancip relatif terhadap sumbu radial yang menghubungkan pusat meristem dan pusat dinding sel baru (Gambar 5e-i) dan mengamati kecenderungan yang jelas bagi sel untuk membelah pada sudut mendekati 90° relatif terhadap sumbu radial, dengan frekuensi tertinggi diamati pada 70–80° (23,28%) dan 80–90° (22,62%) (Gambar 5e,i), yang sesuai dengan pembelahan sel dalam arah melingkar/melintang (Gambar 5h). Untuk memeriksa kontribusi pensinyalan GA terhadap perilaku pembelahan sel ini, kami menganalisis parameter pembelahan sel dalam IPR dan non-IPR secara terpisah (Gambar 5i). Kami mengamati bahwa distribusi sudut pembelahan pada sel IPR berbeda dari sel non-IPR atau sel di seluruh SAM, dengan sel IPR menunjukkan proporsi pembelahan sel lateral/melingkar yang lebih tinggi, yaitu 70–80° dan 80–90° (masing-masing 33,86% dan 30,71%) (Gambar 5i). Dengan demikian, pengamatan kami mengungkapkan hubungan antara sinyal GA yang tinggi dan orientasi bidang pembelahan sel yang mendekati arah melingkar, mirip dengan korelasi antara aktivitas sinyal GA dan anisotropi pertumbuhan (Gambar 5c, d). Untuk lebih memastikan konservasi spasial dari hubungan ini, kami mengukur orientasi bidang pembelahan pada sel IPR yang mengelilingi primordium mulai dari P3, karena aktivitas sinyal GA tertinggi terdeteksi di wilayah ini mulai dari P4 (Gambar 4). Sudut pembelahan IPR di sekitar P3 dan P4 tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik, meskipun peningkatan frekuensi pembelahan sel lateral diamati pada IPR di sekitar P4 (Gambar 5j). Namun, pada sel IPR di sekitar P5, perbedaan orientasi bidang pembelahan sel menjadi signifikan secara statistik, dengan peningkatan tajam frekuensi pembelahan sel transversal (Gambar 5j). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa pensinyalan GA dapat mengontrol orientasi pembelahan sel di SAM, yang konsisten dengan laporan sebelumnya40,41 bahwa pensinyalan GA yang tinggi dapat menginduksi orientasi lateral pembelahan sel di IPR.
Diperkirakan bahwa sel-sel di IPR tidak akan dimasukkan ke dalam primordia tetapi ke dalam internodus2,42,43. Orientasi transversal pembelahan sel di IPR dapat menghasilkan organisasi khas barisan memanjang paralel sel epidermis di internodus. Pengamatan kami yang dijelaskan di atas menunjukkan bahwa pensinyalan GA kemungkinan berperan dalam proses ini dengan mengatur arah pembelahan sel.
Hilangnya fungsi beberapa gen DELLA mengakibatkan respons GA konstitutif, dan mutan della dapat digunakan untuk menguji hipotesis ini44. Pertama, kami menganalisis pola ekspresi lima gen DELLA di SAM. Fusi transkripsi dari garis GUS45 mengungkapkan bahwa GAI, RGA, RGL1, dan RGL2 (dalam jumlah yang jauh lebih sedikit) diekspresikan di SAM (Gambar Tambahan 11a–d). Hibridisasi in situ lebih lanjut menunjukkan bahwa mRNA GAI terakumulasi secara spesifik di primordia dan bunga yang sedang berkembang (Gambar Tambahan 11e). mRNA RGL1 dan RGL3 terdeteksi di seluruh kanopi SAM dan di bunga yang lebih tua, sedangkan mRNA RGL2 lebih melimpah di daerah perbatasan (Gambar Tambahan 11f–h). Pencitraan konfokal pRGL3::RGL3-GFP SAM mengkonfirmasi ekspresi yang diamati oleh hibridisasi in situ dan menunjukkan bahwa protein RGL3 terakumulasi di bagian tengah SAM (Gambar Tambahan 11i). Dengan menggunakan galur pRGA::GFP-RGA, kami juga menemukan bahwa protein RGA terakumulasi di SAM, tetapi kelimpahannya menurun di perbatasan mulai dari P4 (Gambar Tambahan 11j). Perlu dicatat, pola ekspresi RGL3 dan RGA konsisten dengan aktivitas pensinyalan GA yang lebih tinggi di IPR, seperti yang terdeteksi oleh qmRGA (Gambar 4). Lebih jauh lagi, data ini menunjukkan bahwa semua DELLA diekspresikan di SAM dan ekspresinya secara kolektif mencakup seluruh SAM.
Selanjutnya, kami menganalisis parameter pembelahan sel pada SAM tipe liar (Ler, kontrol) dan mutan gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) (Gambar 6a, b). Menariknya, kami mengamati pergeseran yang signifikan secara statistik dalam distribusi frekuensi sudut pembelahan sel pada SAM mutan della global dibandingkan dengan tipe liar (Gambar 6c). Perubahan pada mutan della global ini disebabkan oleh peningkatan frekuensi sudut 80–90° (34,71% vs. 24,55%) dan, pada tingkat yang lebih rendah, sudut 70–80° (23,78% vs. 20,18%), yaitu, yang sesuai dengan pembelahan sel transversal (Gambar 6c). Frekuensi pembelahan non-transversal (0–60°) juga lebih rendah pada mutan della global (Gambar 6c). Frekuensi pembelahan sel transversal meningkat secara signifikan di SAM mutan della global (Gambar 6b). Frekuensi pembelahan sel transversal di IPR juga lebih tinggi pada mutan della global dibandingkan dengan tipe liar (Gambar 6d). Di luar wilayah IPR, tipe liar memiliki distribusi sudut pembelahan sel yang lebih seragam, sedangkan mutan della global lebih menyukai pembelahan tangensial seperti IPR (Gambar 6e). Kami juga mengukur orientasi pembelahan sel di SAM mutan ga2 oksidase (ga2ox) rangkap lima (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, dan ga2ox6-2), latar belakang mutan GA-tidak aktif di mana GA terakumulasi. Sesuai dengan peningkatan kadar GA, SAM dari perbungaan mutan ga2ox rangkap lima lebih besar daripada Col-0 (Gambar Tambahan 12a, b), dan dibandingkan dengan Col-0, SAM ga2ox rangkap lima menunjukkan distribusi sudut pembelahan sel yang berbeda secara jelas, dengan frekuensi sudut meningkat dari 50° menjadi 90°, yaitu kembali mendukung pembelahan tangensial (Gambar Tambahan 12a–c). Dengan demikian, kami menunjukkan bahwa aktivasi konstitutif sinyal GA dan akumulasi GA menginduksi pembelahan sel lateral di IPR dan bagian SAM lainnya.
a, b Visualisasi 3D lapisan L1 dari SAM mutan Ler (a) dan global della (b) yang diwarnai PI menggunakan mikroskopi konfokal. Dinding sel baru yang terbentuk di SAM (tetapi bukan primordium) selama periode 10 jam ditunjukkan dan diwarnai sesuai dengan nilai sudutnya. Sisipan menunjukkan SAM pada 0 jam. Bilah warna ditampilkan di sudut kanan bawah. Panah pada (b) menunjuk ke contoh berkas sel yang sejajar pada mutan global della. Percobaan diulang dua kali dengan hasil yang serupa. Perbandingan distribusi frekuensi orientasi bidang pembelahan sel di seluruh SAM (d), IPR (e), dan non-IPR (f) antara Ler dan global della. Nilai P diperoleh menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov dua arah. f, g Visualisasi 3D dari citra konfokal SAM yang diwarnai PI dari tanaman transgenik Col-0 (i) dan pCUC2::gai-1-VENUS (j). Panel (a, b) menunjukkan dinding sel baru (tetapi bukan primordia) yang terbentuk di SAM dalam waktu 10 jam. Percobaan diulang dua kali dengan hasil yang serupa. h–j Perbandingan distribusi frekuensi orientasi bidang pembelahan sel yang terletak di seluruh SAM (h), IPR (i) dan non-IPR (j) antara tanaman Col-0 dan pCUC2::gai-1-VENUS. Nilai P diperoleh menggunakan uji Kolmogorov–Smirnov dua arah.
Selanjutnya, kami menguji efek penghambatan sinyal GA secara spesifik di IPR. Untuk tujuan ini, kami menggunakan promotor cotyledon cup 2 (CUC2) untuk menggerakkan ekspresi protein gai-1 dominan negatif yang menyatu dengan VENUS (pada galur pCUC2::gai-1-VENUS). Pada SAM tipe liar, promotor CUC2 menggerakkan ekspresi sebagian besar IPR di SAM, termasuk sel-sel perbatasan, mulai dari P4 dan seterusnya, dan ekspresi spesifik serupa diamati pada tanaman pCUC2::gai-1-VENUS (lihat di bawah). Distribusi sudut pembelahan sel di seluruh SAM atau IPR tanaman pCUC2::gai-1-VENUS tidak berbeda secara signifikan dari tipe liar, meskipun secara tak terduga kami menemukan bahwa sel-sel tanpa IPR pada tanaman ini membelah dengan frekuensi yang lebih tinggi yaitu 80–90° (Gambar 6f–j).
Telah dikemukakan bahwa arah pembelahan sel bergantung pada geometri SAM, khususnya tegangan tarik yang dihasilkan oleh kelengkungan jaringan46. Oleh karena itu, kami menanyakan apakah bentuk SAM berubah pada mutan della global dan tanaman pCUC2::gai-1-VENUS. Seperti yang dilaporkan sebelumnya12, ukuran SAM mutan della global lebih besar daripada tipe liar (Gambar Tambahan 13a, b, d). Hibridisasi in situ CLV3 dan RNA STM mengkonfirmasi perluasan meristem pada mutan della dan lebih lanjut menunjukkan perluasan lateral ceruk sel punca (Gambar Tambahan 13e, f, h, i). Namun, kelengkungan SAM serupa pada kedua genotipe (Gambar Tambahan 13k, m, n, p). Kami mengamati peningkatan ukuran yang serupa pada mutan gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple tanpa perubahan kelengkungan dibandingkan dengan tipe liar (Gambar Tambahan 13c, d, g, j, l, o, p). Frekuensi orientasi pembelahan sel juga terpengaruh pada mutan della quadruple, tetapi pada tingkat yang lebih rendah daripada pada mutan della monolitik (Gambar Tambahan 12d–f). Efek dosis ini, bersama dengan tidak adanya efek pada kelengkungan, menunjukkan bahwa aktivitas RGL3 residual pada mutan Della quadruple membatasi perubahan orientasi pembelahan sel yang disebabkan oleh hilangnya aktivitas DELLA dan bahwa perubahan pada pembelahan sel lateral terjadi sebagai respons terhadap perubahan aktivitas pensinyalan GA daripada perubahan geometri SAM. Seperti yang dijelaskan di atas, promotor CUC2 menggerakkan ekspresi IPR di SAM mulai dari P4 (Gambar Tambahan 14a, b), dan sebaliknya, SAM pCUC2::gai-1-VENUS memiliki ukuran yang lebih kecil tetapi kelengkungan yang lebih tinggi (Gambar Tambahan 14c–h). Perubahan morfologi SAM pCUC2::gai-1-VENUS ini dapat menghasilkan distribusi tegangan mekanik yang berbeda dibandingkan dengan tipe liar, di mana tegangan lingkar yang tinggi dimulai pada jarak yang lebih pendek dari pusat SAM47. Atau, perubahan morfologi SAM pCUC2::gai-1-VENUS dapat disebabkan oleh perubahan sifat mekanik regional yang diinduksi oleh ekspresi transgen48. Dalam kedua kasus tersebut, hal ini dapat sebagian mengimbangi efek perubahan sinyal GA dengan meningkatkan kemungkinan sel akan membelah dalam orientasi lingkar/transversal, yang menjelaskan pengamatan kami.
Secara keseluruhan, data kami mengkonfirmasi bahwa sinyal GA yang lebih tinggi berperan aktif dalam orientasi lateral bidang pembelahan sel pada IPR. Data tersebut juga menunjukkan bahwa kelengkungan meristem juga memengaruhi orientasi bidang pembelahan sel pada IPR.
Orientasi transversal bidang pembelahan di IPR, karena aktivitas sinyal GA yang tinggi, menunjukkan bahwa GA mengatur terlebih dahulu susunan sel radial di epidermis dalam SAM untuk menentukan organisasi seluler yang nantinya akan ditemukan di internode epidermis. Memang, susunan sel tersebut sering terlihat pada gambar SAM mutan della global (Gambar 6b). Oleh karena itu, untuk mengeksplorasi lebih lanjut fungsi perkembangan pola spasial sinyal GA di SAM, kami menggunakan pencitraan time-lapse untuk menganalisis organisasi spasial sel di IPR pada tanaman tipe liar (Ler dan Col-0), mutan della global, dan tanaman transgenik pCUC2::gai-1-VENUS.
Kami menemukan bahwa qmRGA menunjukkan bahwa aktivitas pensinyalan GA di IPR meningkat dari P1/P2 dan mencapai puncaknya pada P4, dan pola ini tetap konstan dari waktu ke waktu (Gambar 4a–f dan Gambar Tambahan 8c–f, k). Untuk menganalisis organisasi spasial sel-sel di IPR dengan peningkatan sinyal GA, kami memberi label sel-sel IPR Ler di atas dan di sisi P4 sesuai dengan nasib perkembangannya yang dianalisis 34 jam setelah pengamatan pertama, yaitu, lebih dari dua waktu plastida, memungkinkan kami untuk mengikuti sel-sel IPR selama perkembangan primordium dari P1/P2 hingga P4. Kami menggunakan tiga warna berbeda: kuning untuk sel-sel yang terintegrasi ke dalam primordium di dekat P4, hijau untuk sel-sel yang berada di IPR, dan ungu untuk sel-sel yang berpartisipasi dalam kedua proses tersebut (Gambar 7a–c). Pada t0 (0 jam), 1–2 lapisan sel IPR terlihat di depan P4 (Gambar 7a). Seperti yang diharapkan, ketika sel-sel ini membelah, mereka melakukannya terutama melalui bidang pembelahan transversal (Gambar 7a–c). Hasil serupa diperoleh menggunakan Col-0 SAM (berfokus pada P3, yang lipatan batasnya mirip dengan P4 pada Ler), meskipun pada genotipe ini lipatan yang terbentuk di batas bunga menyembunyikan sel-sel IPR lebih cepat (Gambar 7g–i). Dengan demikian, pola pembelahan sel-sel IPR mengatur sel-sel tersebut menjadi baris radial, seperti pada ruas batang. Pengorganisasian baris radial dan lokalisasi sel-sel IPR di antara organ-organ yang berurutan menunjukkan bahwa sel-sel ini adalah progenitor internodal.
Di sini, kami mengembangkan biosensor sinyal GA ratiometrik, qmRGA, yang memungkinkan pemetaan kuantitatif aktivitas sinyal GA yang dihasilkan dari kombinasi konsentrasi GA dan reseptor GA sambil meminimalkan interferensi dengan jalur sinyal endogen, sehingga memberikan informasi tentang fungsi GA pada tingkat seluler. Untuk tujuan ini, kami membangun protein DELLA yang dimodifikasi, mRGA, yang telah kehilangan kemampuan untuk mengikat mitra interaksi DELLA tetapi tetap sensitif terhadap proteolisis yang diinduksi GA. qmRGA merespons perubahan eksogen dan endogen pada kadar GA, dan sifat penginderaannya yang dinamis memungkinkan penilaian perubahan spasial dan temporal dalam aktivitas sinyal GA selama perkembangan. qmRGA juga merupakan alat yang sangat fleksibel karena dapat diadaptasi ke jaringan yang berbeda dengan mengubah promotor yang digunakan untuk ekspresinya (jika perlu), dan mengingat sifat konservatif jalur sinyal GA dan motif PFYRE di seluruh angiosperma, kemungkinan besar dapat ditransfer ke spesies lain22. Sejalan dengan hal ini, mutasi yang setara pada protein SLR1 DELLA padi (HYY497AAA) juga terbukti menekan aktivitas penekan pertumbuhan SLR1 sementara hanya sedikit mengurangi degradasi yang dimediasi GA, mirip dengan mRGA23. Perlu dicatat, studi terbaru pada Arabidopsis menunjukkan bahwa mutasi asam amino tunggal pada domain PFYRE (S474L) mengubah aktivitas transkripsi RGA tanpa memengaruhi kemampuannya untuk berinteraksi dengan mitra faktor transkripsi50. Meskipun mutasi ini sangat dekat dengan 3 substitusi asam amino yang ada pada mRGA, studi kami menunjukkan bahwa kedua mutasi ini mengubah karakteristik DELLA yang berbeda. Meskipun sebagian besar mitra faktor transkripsi berikatan dengan domain LHR1 dan SAW dari DELLA26,51, beberapa asam amino yang terkonservasi dalam domain PFYRE dapat membantu menstabilkan interaksi ini.
Perkembangan ruas batang merupakan ciri kunci dalam arsitektur tanaman dan peningkatan hasil panen. qmRGA mengungkapkan aktivitas sinyal GA yang lebih tinggi pada sel progenitor ruas batang IPR. Dengan menggabungkan pencitraan kuantitatif dan genetika, kami menunjukkan bahwa pola sinyal GA menumpuk bidang pembelahan sel melingkar/melintang di epidermis SAM, membentuk organisasi pembelahan sel yang diperlukan untuk perkembangan ruas batang. Beberapa regulator orientasi bidang pembelahan sel telah diidentifikasi selama perkembangan52,53. Penelitian kami memberikan contoh yang jelas tentang bagaimana aktivitas sinyal GA mengatur parameter seluler ini. DELLA dapat berinteraksi dengan kompleks protein pra-lipatan41, sehingga sinyal GA dapat mengatur orientasi bidang pembelahan sel dengan secara langsung memengaruhi orientasi mikrotubulus kortikal40,41,54,55. Secara tak terduga, kami menunjukkan bahwa di SAM, korelasi dari aktivitas sinyal GA yang lebih tinggi bukanlah pemanjangan atau pembelahan sel, tetapi hanya anisotropi pertumbuhan, yang konsisten dengan efek langsung GA pada arah pembelahan sel di IPR. Namun, kita tidak dapat mengesampingkan kemungkinan bahwa efek ini juga bersifat tidak langsung, misalnya dimediasi oleh pelunakan dinding sel yang diinduksi GA56. Perubahan sifat dinding sel menginduksi stres mekanik57,58, yang juga dapat memengaruhi orientasi bidang pembelahan sel dengan memengaruhi orientasi mikrotubulus kortikal39,46,59. Efek gabungan dari stres mekanik yang diinduksi GA dan regulasi langsung orientasi mikrotubulus oleh GA mungkin terlibat dalam menghasilkan pola spesifik orientasi pembelahan sel di IPR untuk mendefinisikan internode, dan studi lebih lanjut diperlukan untuk menguji gagasan ini. Demikian pula, studi sebelumnya telah menyoroti pentingnya protein yang berinteraksi dengan DELLA, TCP14 dan 15, dalam pengendalian pembentukan internode60,61 dan faktor-faktor ini dapat memediasi aksi GA bersama dengan BREVIPEDICELLUS (BP) dan PENNYWISE (PNY), yang mengatur perkembangan internode dan telah terbukti memengaruhi pensinyalan GA2,62. Mengingat bahwa DELLA berinteraksi dengan jalur pensinyalan brassinosteroid, etilen, asam jasmonat, dan asam absisat (ABA)63,64 dan bahwa hormon-hormon ini dapat memengaruhi orientasi mikrotubulus65, efek GA pada orientasi pembelahan sel mungkin juga dimediasi oleh hormon lain.
Studi sitologi awal menunjukkan bahwa baik daerah dalam maupun luar meristem apikal batang (SAM) Arabidopsis diperlukan untuk perkembangan ruas batang2,42. Fakta bahwa GA secara aktif mengatur pembelahan sel di jaringan bagian dalam12 mendukung fungsi ganda GA dalam mengatur ukuran meristem dan ruas batang di SAM. Pola pembelahan sel terarah juga diatur secara ketat di jaringan SAM bagian dalam, dan pengaturan ini sangat penting untuk pertumbuhan batang52. Akan menarik untuk meneliti apakah GA juga berperan dalam mengarahkan bidang pembelahan sel dalam organisasi SAM bagian dalam, sehingga menyinkronkan spesifikasi dan perkembangan ruas batang di dalam SAM.
Tanaman ditumbuhkan secara in vitro dalam tanah atau media Murashige-Skoog (MS) 1x (Duchefa) yang ditambah dengan 1% sukrosa dan 1% agar (Sigma) di bawah kondisi standar (16 jam cahaya, 22 °C), kecuali untuk percobaan pertumbuhan hipokotil dan akar di mana bibit ditanam pada cawan vertikal di bawah cahaya konstan dan suhu 22 °C. Untuk percobaan nitrat, tanaman ditanam pada media MS yang dimodifikasi (media tanaman bioWORLD) yang ditambah dengan nitrat yang cukup (0 atau 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-suksinat, 1% sukrosa dan 1% A-agar (Sigma) di bawah kondisi hari panjang.
cDNA GID1a yang dimasukkan ke dalam pDONR221 direkombinasi dengan pDONR P4-P1R-pUBQ10 dan pDONR P2R-P3-mCherry ke dalam pB7m34GW untuk menghasilkan pUBQ10::GID1a-mCherry. DNA IDD2 yang dimasukkan ke dalam pDONR221 direkombinasi ke dalam pB7RWG266 untuk menghasilkan p35S:IDD2-RFP. Untuk menghasilkan pGID1b::2xmTQ2-GID1b, fragmen 3,9 kb di hulu wilayah pengkodean GID1b dan fragmen 4,7 kb yang mengandung cDNA GID1b (1,3 kb) dan terminator (3,4 kb) pertama-tama diamplifikasi menggunakan primer pada Tabel Tambahan 3 dan kemudian dimasukkan ke dalam pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) dan pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), masing-masing, dan akhirnya direkombinasi dengan pDONR221 2xmTQ268 ke dalam vektor target pGreen 012567 menggunakan kloning Gateway. Untuk menghasilkan pCUC2::LSSmOrange, sekuens promotor CUC2 (3229 bp di hulu ATG) diikuti oleh sekuens pengkodean large Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange)69 dengan sinyal lokalisasi nuklir N7 dan terminator transkripsi NOS dirakit ke dalam vektor penargetan kanamisin pGreen menggunakan sistem rekombinasi 3-fragmen Gateway (Invitrogen). Vektor biner tanaman dimasukkan ke dalam strain Agrobacterium tumefaciens GV3101 dan dimasukkan ke dalam daun Nicotiana benthamiana dengan metode infiltrasi Agrobacterium dan ke dalam Arabidopsis thaliana Col-0 dengan metode pencelupan bunga, masing-masing. pUBQ10::qmRGA, pUBQ10::GID1a-mCherry, dan pCLV3::mCherry-NLS qmRGA diisolasi dari keturunan F3 dan F1 dari persilangan masing-masing.
Hibridisasi RNA in situ dilakukan pada ujung tunas sepanjang kurang lebih 1 cm72, yang dikumpulkan dan segera difiksasi dalam larutan FAA (3,7% formaldehida, 5% asam asetat, 50% etanol) yang telah didinginkan hingga 4 °C. Setelah 2 × 15 menit perlakuan vakum, fiksatif diganti dan sampel diinkubasi semalaman. cDNA GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, dan RGL3 serta probe antisense ke 3′-UTR-nya disintesis menggunakan primer yang ditunjukkan pada Tabel Tambahan 3 seperti yang dijelaskan oleh Rosier dkk.73. Probe berlabel digoxigenin dideteksi secara imunologis menggunakan antibodi digoxigenin (pengenceran 3000 kali; Roche, nomor katalog: 11 093 274 910), dan bagian-bagiannya diwarnai dengan larutan 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, pengenceran 250 kali)/nitroblue tetrazolium (NBT, pengenceran 200 kali).
Waktu posting: 10 Februari 2025