Protein DELLA dilestarikanzat pengatur tumbuhyang memainkan peran sentral dalam perkembangan tanaman sebagai respons terhadap sinyal internal dan eksternal. Sebagai regulator transkripsi, DELLA mengikat faktor transkripsi (TF) dan histon H2A melalui domain GRAS mereka dan direkrut untuk bertindak pada promotor. Studi terbaru menunjukkan bahwa stabilitas DELLA diatur pasca-translasi oleh dua mekanisme: poliubikuitinasi yang diinduksi oleh hormon tanamangiberelin, yang mengarah pada degradasi cepat mereka, dan konjugasi dengan pengubah kecil seperti ubiquitin (SUMO), yang meningkatkan akumulasi mereka. Selain itu, aktivitas DELLA diatur secara dinamis oleh dua mekanisme glikosilasi yang berbeda: O-fucosilasi meningkatkan interaksi DELLA-TF, sedangkan modifikasi N-asetilglukosamin (O-GlcNAc) yang terkait-O menghambat interaksi DELLA-TF. Namun, peran fosforilasi DELLA tidak jelas karena penelitian sebelumnya telah menunjukkan hasil yang bertentangan, dengan beberapa yang menunjukkan bahwa fosforilasi mendorong atau menekan degradasi DELLA dan yang lainnya menunjukkan bahwa fosforilasi tidak memengaruhi stabilitas mereka. Di sini, kami mengidentifikasi situs fosforilasi dalam represor GA1-3 (RGA), AtDELLA, yang dimurnikan dari Arabidopsis thaliana dengan spektrometri massa dan menunjukkan bahwa fosforilasi dua peptida RGA di daerah PolyS dan PolyS/T meningkatkan aktivitas RGA dengan mempromosikan pengikatan H2A dan asosiasi RGA dengan promotor target. Patut dicatat, fosforilasi tidak memengaruhi interaksi RGA-TF maupun stabilitas RGA. Studi kami mengungkap mekanisme molekuler yang menginduksi aktivitas DELLA melalui fosforilasi.
Analisis spektrometri massa kami mengungkapkan bahwa Pep1 dan Pep2 sangat terfosforilasi dalam RGA pada latar belakang Ga1 yang kekurangan GA. Selain studi ini, studi fosfoproteomik juga telah mengungkapkan fosforilasi Pep1 dalam RGA, meskipun perannya belum dipelajari53,54,55. Sebaliknya, fosforilasi Pep2 belum pernah dijelaskan sebelumnya karena peptida ini hanya dapat dideteksi menggunakan transgen RGAGKG. Meskipun mutasi m1A, yang meniadakan fosforilasi Pep1, hanya sedikit mengurangi aktivitas RGA pada tumbuhan, mutasi tersebut memiliki efek aditif ketika dikombinasikan dengan m2A dalam mengurangi aktivitas RGA (Gambar Tambahan 6). Yang penting, fosforilasi Pep1 berkurang secara signifikan pada mutan sly1 yang ditingkatkan GA dibandingkan dengan ga1, menunjukkan bahwa GA mendorong defosforilasi RGA, sehingga mengurangi aktivitasnya. Mekanisme GA dalam menekan fosforilasi RGA memerlukan penyelidikan lebih lanjut. Salah satu kemungkinan adalah hal ini dicapai melalui regulasi protein kinase yang belum teridentifikasi. Meskipun penelitian telah menunjukkan bahwa ekspresi protein kinase CK1 EL1 diturunkan oleh GA pada tanaman padi41, hasil kami menunjukkan bahwa mutasi tingkat tinggi homolog EL1 Arabidopsis (AEL1-4) tidak mengurangi fosforilasi RGA. Senada dengan hasil kami, studi fosfoproteomik terbaru menggunakan galur Arabidopsis AEL yang mengekspresikan secara berlebihan dan mutan tripel ael tidak mengidentifikasi protein DELLA sebagai substrat kinase tersebut56. Ketika kami menyiapkan naskah, dilaporkan bahwa GSK3, gen yang mengkode kinase mirip GSK3/SHAGGY pada gandum (Triticum aestivum), dapat memfosforilasi DELLA (Rht-B1b)57, meskipun fosforilasi Rht-B1b oleh GSK3 belum terkonfirmasi pada tanaman. Reaksi enzimatik in vitro dengan adanya GSK3 yang dilanjutkan dengan analisis spektrometri massa mengungkapkan tiga situs fosforilasi yang terletak di antara domain DELLA dan GRAS Rht-B1b (Gambar Tambahan 3). Substitusi serin menjadi alanin pada ketiga situs fosforilasi tersebut mengakibatkan penurunan aktivitas Rht-B1b pada gandum transgenik, konsisten dengan temuan kami bahwa substitusi alanin pada Pep2 RGA menurunkan aktivitas RGA. Namun, uji degradasi protein in vitro lebih lanjut menunjukkan bahwa fosforilasi juga dapat menstabilkan Rht-B1b57. Hal ini berbeda dengan hasil kami yang menunjukkan bahwa substitusi alanin pada Pep2 RGA tidak mengubah stabilitasnya secara in planta. GSK3 dalam gandum merupakan homolog dari brassinosteroid-insensitive protein 2 (BIN2) dalam Arabidopsis 57. BIN2 merupakan pengatur negatif sinyal BR, dan BR mengaktifkan jalur sinyalnya dengan menyebabkan degradasi BIN2 58. Kami menunjukkan bahwa perlakuan BR tidak mengurangi stabilitas RGA 59 atau tingkat fosforilasi dalam Arabidopsis (Gambar Tambahan 2), yang menunjukkan bahwa RGA tidak mungkin difosforilasi oleh BIN2.
Semua data kuantitatif dianalisis secara statistik menggunakan Excel, dan perbedaan signifikan ditentukan menggunakan uji-t Student. Tidak ada metode statistik yang digunakan untuk menentukan ukuran sampel sebelumnya. Tidak ada data yang dikecualikan dari analisis; eksperimen tidak diacak; dan para peneliti mengetahui alokasi sampel selama eksperimen dan penilaian hasil. Ukuran sampel tersedia dalam legenda gambar dan berkas data mentah.
Waktu posting: 15-Apr-2025