Protein DELLA bersifat lestaripengatur pertumbuhanyang memainkan peran sentral dalam perkembangan tanaman sebagai respons terhadap sinyal internal dan eksternal. Sebagai regulator transkripsi, DELLA berikatan dengan faktor transkripsi (TF) dan histon H2A melalui domain GRAS mereka dan direkrut untuk bekerja pada promotor. Studi terbaru menunjukkan bahwa stabilitas DELLA diatur secara pasca-translasi oleh dua mekanisme: poliubikuitinasi yang diinduksi oleh hormon tanamangiberelin, yang menyebabkan degradasi cepatnya, dan konjugasi dengan pengubah mirip ubiquitin kecil (SUMO), yang meningkatkan akumulasinya. Selain itu, aktivitas DELLA diatur secara dinamis oleh dua mekanisme glikosilasi yang berbeda: O-fukosilasi meningkatkan interaksi DELLA-TF, sedangkan modifikasi O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) menghambat interaksi DELLA-TF. Namun, peran fosforilasi DELLA masih belum jelas karena penelitian sebelumnya menunjukkan hasil yang bertentangan, dengan beberapa penelitian menunjukkan bahwa fosforilasi mendorong atau menekan degradasi DELLA dan penelitian lain menunjukkan bahwa fosforilasi tidak memengaruhi stabilitasnya. Di sini, kami mengidentifikasi situs fosforilasi pada represor GA1-3 (RGA), AtDELLA, yang dimurnikan dari Arabidopsis thaliana dengan spektrometri massa dan menunjukkan bahwa fosforilasi dua peptida RGA di wilayah PolyS dan PolyS/T meningkatkan aktivitas RGA dengan mendorong pengikatan H2A dan asosiasi RGA dengan promotor target. Perlu dicatat bahwa fosforilasi tidak memengaruhi interaksi RGA-TF atau stabilitas RGA. Studi kami mengungkapkan mekanisme molekuler di mana fosforilasi menginduksi aktivitas DELLA.
Analisis spektrometri massa kami mengungkapkan bahwa Pep1 dan Pep2 sama-sama terfosforilasi tinggi di RGA pada latar belakang Ga1 yang kekurangan GA. Selain penelitian ini, studi fosfoproteomik juga mengungkapkan fosforilasi Pep1 di RGA, meskipun perannya belum dipelajari53,54,55. Sebaliknya, fosforilasi Pep2 belum pernah dijelaskan sebelumnya karena peptida ini hanya dapat dideteksi menggunakan transgen RGAGKG. Meskipun mutasi m1A, yang menghilangkan fosforilasi Pep1, hanya sedikit mengurangi aktivitas RGA di dalam tanaman, mutasi ini memiliki efek aditif ketika dikombinasikan dengan m2A dalam mengurangi aktivitas RGA (Gambar Tambahan 6). Yang penting, fosforilasi Pep1 secara signifikan berkurang pada mutan sly1 yang ditingkatkan GA dibandingkan dengan ga1, menunjukkan bahwa GA mendorong defosforilasi RGA, mengurangi aktivitasnya. Mekanisme di mana GA menekan fosforilasi RGA membutuhkan penyelidikan lebih lanjut. Salah satu kemungkinannya adalah hal ini dicapai melalui pengaturan protein kinase yang tidak teridentifikasi. Meskipun penelitian telah menunjukkan bahwa ekspresi protein kinase CK1 EL1 diturunkan oleh GA pada padi41, hasil kami menunjukkan bahwa mutasi tingkat tinggi homolog Arabidopsis EL1 (AEL1-4) tidak mengurangi fosforilasi RGA. Sesuai dengan hasil kami, sebuah studi fosfoproteomik baru-baru ini menggunakan galur Arabidopsis yang mengekspresikan AEL secara berlebihan dan mutan rangkap tiga ael tidak mengidentifikasi protein DELLA sebagai substrat dari kinase ini56. Ketika kami menyiapkan manuskrip ini, dilaporkan bahwa GSK3, gen yang mengkode kinase mirip GSK3/SHAGGY pada gandum (Triticum aestivum), dapat memfosforilasi DELLA (Rht-B1b)57, meskipun fosforilasi Rht-B1b oleh GSK3 belum dikonfirmasi pada tanaman. Reaksi enzimatik in vitro dengan adanya GSK3 yang diikuti analisis spektrometri massa mengungkapkan tiga situs fosforilasi yang terletak di antara domain DELLA dan GRAS dari Rht-B1b (Gambar Tambahan 3). Substitusi serin menjadi alanin pada ketiga situs fosforilasi tersebut mengakibatkan penurunan aktivitas Rht-B1b pada gandum transgenik, konsisten dengan temuan kami bahwa substitusi alanin pada Pep2 RGA menurunkan aktivitas RGA. Namun, uji degradasi protein in vitro lebih lanjut menunjukkan bahwa fosforilasi juga dapat menstabilkan Rht-B1b57. Hal ini bertentangan dengan hasil kami yang menunjukkan bahwa substitusi alanin pada Pep2 RGA tidak mengubah stabilitasnya di dalam tanaman. GSK3 pada gandum merupakan ortolog dari protein 2 yang tidak sensitif terhadap brassinosteroid (BIN2) pada Arabidopsis 57. BIN2 adalah regulator negatif dari pensinyalan BR, dan BR mengaktifkan jalur pensinyalannya dengan menyebabkan degradasi BIN2 58. Kami menunjukkan bahwa perlakuan BR tidak mengurangi stabilitas RGA 59 atau tingkat fosforilasi pada Arabidopsis (Gambar Tambahan 2), yang menunjukkan bahwa RGA kemungkinan tidak difosforilasi oleh BIN2.
Semua data kuantitatif dianalisis secara statistik menggunakan Excel, dan perbedaan signifikan ditentukan menggunakan uji t Student. Tidak ada metode statistik yang digunakan untuk menentukan ukuran sampel sebelumnya. Tidak ada data yang dikecualikan dari analisis; percobaan tidak diacak; dan para peneliti mengetahui alokasi selama percobaan dan penilaian hasil. Ukuran sampel diberikan dalam keterangan gambar dan dalam file data mentah.
Waktu posting: 15 April 2025