Studi ini mengkaji tingkat kematian, tingkat kematian sekunder, dan tingkat toksisitas dari obat-obatan komersial.sipermetrinformulasi untuk berudu anuran. Dalam uji akut, konsentrasi 100–800 μg/L diuji selama 96 jam. Dalam uji kronis, konsentrasi sipermetrin yang terjadi secara alami (1, 3, 6, dan 20 μg/L) diuji untuk mortalitas, diikuti oleh pengujian mikronukleus dan kelainan inti sel darah merah selama 7 hari. LC50 dari formulasi sipermetrin komersial untuk berudu adalah 273,41 μg L−1. Dalam uji kronis, konsentrasi tertinggi (20 μg L−1) mengakibatkan mortalitas lebih dari 50%, karena membunuh setengah dari berudu yang diuji. Uji mikronukleus menunjukkan hasil yang signifikan pada 6 dan 20 μg L−1 dan beberapa kelainan inti terdeteksi, yang menunjukkan bahwa formulasi sipermetrin komersial memiliki potensi genotoksis terhadap P. gracilis. Sipermetrin berisiko tinggi bagi spesies ini, yang menunjukkan bahwa zat ini dapat menyebabkan berbagai masalah dan memengaruhi dinamika ekosistem ini dalam jangka pendek dan panjang. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa formulasi sipermetrin komersial memiliki efek toksik terhadap P. gracilis.
Karena adanya perluasan kegiatan pertanian yang terus menerus dan penerapan teknologi secara intensif,pengendalian hamatindakan, hewan akuatik sering terpapar pestisida1,2. Pencemaran sumber daya air di dekat lahan pertanian dapat memengaruhi perkembangan dan kelangsungan hidup organisme non-target seperti amfibi.
Amfibi menjadi semakin penting dalam penilaian matriks lingkungan. Anura dianggap sebagai bioindikator yang baik untuk polutan lingkungan karena karakteristik uniknya seperti siklus hidup yang kompleks, laju pertumbuhan larva yang cepat, status trofik, kulit yang permeabel10,11, ketergantungan pada air untuk reproduksi12 dan telur yang tidak terlindungi11,13,14. Katak air kecil (Physalaemus gracilis), yang umumnya dikenal sebagai katak menangis, telah terbukti menjadi spesies bioindikator polusi pestisida4,5,6,7,15. Spesies ini ditemukan di perairan yang tergenang, kawasan lindung atau kawasan dengan habitat yang bervariasi di Argentina, Uruguay, Paraguay dan Brasil1617 dan dianggap stabil oleh klasifikasi IUCN karena distribusinya yang luas dan toleransinya terhadap habitat yang berbeda18.
Efek subletal telah dilaporkan pada amfibi setelah terpapar sipermetrin, termasuk perubahan perilaku, morfologi, dan biokimia pada berudu23,24,25, perubahan mortalitas dan waktu metamorfosis, perubahan enzimatik, penurunan keberhasilan penetasan24,25, hiperaktivitas26, penghambatan aktivitas kolinesterase27, dan perubahan dalam performa berenang7,28. Namun, studi tentang efek genotoksis sipermetrin pada amfibi terbatas. Oleh karena itu, penting untuk menilai kerentanan spesies anuran terhadap sipermetrin.
Polusi lingkungan memengaruhi pertumbuhan dan perkembangan normal amfibi, tetapi efek samping yang paling serius adalah kerusakan genetik pada DNA yang disebabkan oleh paparan pestisida13. Analisis morfologi sel darah merupakan bioindikator penting dari polusi dan potensi toksisitas suatu zat terhadap spesies liar29. Uji mikronukleus merupakan salah satu metode yang paling umum digunakan untuk menentukan genotoksisitas bahan kimia di lingkungan30. Ini merupakan metode yang cepat, efektif, dan murah yang merupakan indikator yang baik dari polusi kimia pada organisme seperti amfibi31,32 dan dapat memberikan informasi tentang paparan polutan genotoksis33.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi potensi toksik formulasi sipermetrin komersial terhadap kecebong air kecil menggunakan uji mikronukleus dan penilaian risiko ekologi.
Mortalitas kumulatif (%) kecebong P. gracilis yang terpapar berbagai konsentrasi sipermetrin komersial selama periode akut pengujian.
Mortalitas kumulatif (%) kecebong P. gracilis yang terpapar berbagai konsentrasi sipermetrin komersial selama pengujian kronis.
Mortalitas tinggi yang diamati adalah akibat dari efek genotoksis pada amfibi yang terpapar berbagai konsentrasi sipermetrin (6 dan 20 μg/L), sebagaimana dibuktikan oleh keberadaan mikronuklei (MN) dan kelainan nuklir pada eritrosit. Pembentukan MN menunjukkan kesalahan dalam mitosis dan dikaitkan dengan pengikatan kromosom yang buruk ke mikrotubulus, cacat pada kompleks protein yang bertanggung jawab untuk penyerapan dan pengangkutan kromosom, kesalahan dalam segregasi kromosom dan kesalahan dalam perbaikan kerusakan DNA38,39 dan mungkin terkait dengan stres oksidatif yang disebabkan oleh pestisida40,41. Kelainan lain diamati pada semua konsentrasi yang dievaluasi. Peningkatan konsentrasi sipermetrin meningkatkan kelainan nuklir pada eritrosit sebesar 5% dan 20% pada dosis terendah (1 μg/L) dan tertinggi (20 μg/L). Misalnya, perubahan dalam DNA suatu spesies dapat memiliki konsekuensi serius bagi kelangsungan hidup jangka pendek dan jangka panjang, yang mengakibatkan penurunan populasi, perubahan kebugaran reproduksi, perkawinan sedarah, hilangnya keragaman genetik, dan perubahan laju migrasi. Semua faktor ini dapat memengaruhi kelangsungan hidup dan pemeliharaan spesies42,43. Pembentukan kelainan eritroid dapat mengindikasikan adanya hambatan dalam sitokinesis, yang mengakibatkan pembelahan sel abnormal (eritrosit berinti ganda)44,45; nukleus multilobus adalah tonjolan membran nukleus dengan banyak lobus46, sementara kelainan eritroid lainnya dapat dikaitkan dengan amplifikasi DNA, seperti ginjal/bleb nukleus47. Keberadaan eritrosit anukleat dapat mengindikasikan gangguan transportasi oksigen, terutama dalam air yang terkontaminasi48,49. Apoptosis mengindikasikan kematian sel50.
Penelitian lain juga telah menunjukkan efek genotoksis dari sipermetrin. Kabaña dkk.51 menunjukkan keberadaan mikronuklei dan perubahan inti seperti sel binukleat dan sel apoptotik pada sel Odontophrynus americanus setelah terpapar konsentrasi tinggi sipermetrin (5000 dan 10.000 μg L−1) selama 96 jam. Apoptosis yang diinduksi sipermetrin juga terdeteksi pada P. biligonigerus52 dan Rhinella arenarum53. Hasil ini menunjukkan bahwa sipermetrin memiliki efek genotoksis pada berbagai organisme akuatik dan bahwa uji MN dan ENA dapat menjadi indikator efek subletal pada amfibi dan dapat diterapkan pada spesies asli dan populasi liar yang terpapar racun12.
Formulasi komersial sipermetrin menimbulkan bahaya lingkungan yang tinggi (baik akut maupun kronis), dengan HQ yang melebihi tingkat Badan Perlindungan Lingkungan AS (EPA)54 yang dapat berdampak buruk pada spesies jika ada di lingkungan. Dalam penilaian risiko kronis, NOEC untuk mortalitas adalah 3 μg L−1, yang mengonfirmasi bahwa konsentrasi yang ditemukan dalam air dapat menimbulkan risiko bagi spesies55. NOEC yang mematikan untuk larva R. arenarum yang terpapar campuran endosulfan dan sipermetrin adalah 500 μg L−1 setelah 168 jam; nilai ini menurun menjadi 0,0005 μg L−1 setelah 336 jam. Penulis menunjukkan bahwa semakin lama paparan, semakin rendah konsentrasi yang berbahaya bagi spesies. Penting juga untuk menyoroti bahwa nilai NOEC lebih tinggi daripada P. gracilis pada waktu paparan yang sama, yang menunjukkan bahwa respons spesies terhadap sipermetrin bersifat spesifik spesies. Lebih jauh lagi, dalam hal mortalitas, nilai CHQ P. gracilis setelah terpapar sipermetrin mencapai 64,67, yang lebih tinggi dari nilai referensi yang ditetapkan oleh Badan Perlindungan Lingkungan AS54, dan nilai CHQ larva R. arenarum juga lebih tinggi dari nilai ini (CHQ > 388,00 setelah 336 jam), yang menunjukkan bahwa insektisida yang diteliti menimbulkan risiko tinggi bagi beberapa spesies amfibi. Mengingat bahwa P. gracilis memerlukan sekitar 30 hari untuk menyelesaikan metamorfosis56, dapat disimpulkan bahwa konsentrasi sipermetrin yang diteliti dapat berkontribusi terhadap penurunan populasi dengan mencegah individu yang terinfeksi memasuki tahap dewasa atau reproduksi pada usia dini.
Dalam penilaian risiko terhitung mikronuklei dan kelainan inti eritrosit lainnya, nilai CHQ berkisar antara 14,92 hingga 97,00, yang menunjukkan bahwa sipermetrin berpotensi menimbulkan risiko genotoksis terhadap P. gracilis bahkan di habitat aslinya. Dengan memperhitungkan mortalitas, konsentrasi maksimum senyawa xenobiotik yang dapat ditoleransi oleh P. gracilis adalah 4,24 μg L−1. Namun, konsentrasi serendah 1 μg/L juga menunjukkan efek genotoksis. Fakta ini dapat menyebabkan peningkatan jumlah individu abnormal57 dan memengaruhi perkembangan serta reproduksi spesies di habitatnya, yang menyebabkan penurunan populasi amfibi.
Formulasi komersial insektisida sipermetrin menunjukkan toksisitas akut dan kronis yang tinggi terhadap P. gracilis. Tingkat kematian yang lebih tinggi diamati, kemungkinan karena efek toksik, sebagaimana dibuktikan oleh adanya mikronuklei dan kelainan inti eritrosit, terutama inti bergerigi, inti berlobus, dan inti vesikular. Selain itu, spesies yang diteliti menunjukkan peningkatan risiko lingkungan, baik akut maupun kronis. Data ini, dikombinasikan dengan penelitian sebelumnya oleh kelompok penelitian kami, menunjukkan bahwa bahkan formulasi komersial sipermetrin yang berbeda masih menyebabkan penurunan aktivitas asetilkolinesterase (AChE) dan butirilkolinesterase (BChE) dan stres oksidatif58, dan mengakibatkan perubahan aktivitas berenang dan malformasi oral59 pada P. gracilis, yang menunjukkan bahwa formulasi komersial sipermetrin memiliki toksisitas mematikan dan submematikan yang tinggi terhadap spesies ini. Hartmann dkk. 60 menemukan bahwa formulasi komersial sipermetrin adalah yang paling beracun bagi P. gracilis dan spesies lain dari genus yang sama (P. cuvieri) dibandingkan dengan sembilan pestisida lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi sipermetrin yang disetujui secara hukum untuk perlindungan lingkungan dapat mengakibatkan kematian yang tinggi dan penurunan populasi jangka panjang.
Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menilai toksisitas pestisida terhadap amfibi, karena konsentrasi yang ditemukan di lingkungan dapat menyebabkan kematian yang tinggi dan menimbulkan risiko potensial terhadap P. gracilis. Penelitian tentang spesies amfibi harus didorong, karena data tentang organisme ini terbatas, terutama pada spesies Brasil.
Uji toksisitas kronis berlangsung selama 168 jam (7 hari) dalam kondisi statis dan konsentrasi subletalnya adalah: 1, 3, 6, dan 20 μg ai L−1. Dalam kedua percobaan, 10 kecebong per kelompok perlakuan dievaluasi dengan enam kali ulangan, dengan total 60 kecebong per konsentrasi. Sementara itu, perlakuan hanya air berfungsi sebagai kontrol negatif. Setiap pengaturan percobaan terdiri dari cawan kaca steril dengan kapasitas 500 ml dan kepadatan 1 kecebong per 50 ml larutan. Labu ditutup dengan film polietilen untuk mencegah penguapan dan terus-menerus diangin-anginkan.
Air dianalisis secara kimia untuk menentukan konsentrasi pestisida pada 0, 96, dan 168 jam. Menurut Sabin et al. 68 dan Martins et al. 69 , analisis dilakukan di Laboratorium Analisis Pestisida (LARP) Universitas Federal Santa Maria menggunakan kromatografi gas yang digabungkan dengan spektrometri massa kuadrupol rangkap tiga (model Varian 1200, Palo Alto, California, AS). Penentuan kuantitatif pestisida dalam air ditunjukkan sebagai materi tambahan (Tabel SM1).
Untuk uji mikronukleus (MNT) dan uji abnormalitas inti sel darah merah (RNA), 15 kecebong dari setiap kelompok perlakuan dianalisis. Kecebong dibius dengan lidokain 5% (50 mg g-170) dan sampel darah dikumpulkan melalui tusukan jantung menggunakan jarum suntik heparin sekali pakai. Apusan darah disiapkan pada slide mikroskop steril, dikeringkan di udara, difiksasi dengan metanol 100% (4 °C) selama 2 menit, lalu diwarnai dengan larutan Giemsa 10% selama 15 menit dalam gelap. Di akhir proses, slide dicuci dengan air suling untuk menghilangkan sisa pewarna dan dikeringkan pada suhu ruangan.
Setidaknya 1000 sel darah merah dari setiap kecebong dianalisis menggunakan mikroskop 100x dengan objektif 71 untuk menentukan keberadaan MN dan ENA. Sebanyak 75.796 sel darah merah dari kecebong dievaluasi dengan mempertimbangkan konsentrasi sipermetrin dan kontrol. Genotoksisitas dianalisis menurut metode Carrasco et al. dan Fenech et al.38,72 dengan menentukan frekuensi lesi nuklir berikut: (1) sel anukleat: sel tanpa nukleus; (2) sel apoptosis: fragmentasi nukleus, kematian sel terprogram; (3) sel binukleat: sel dengan dua nukleus; (4) tunas nukleus atau sel bleb: sel dengan nukleus dengan tonjolan kecil membran nukleus, bleb yang ukurannya mirip dengan mikronuklei; (5) sel kariolisis: sel dengan hanya garis luar nukleus tanpa bahan internal; (6) sel berlekuk: sel dengan nukleus dengan retakan atau lekukan yang jelas dalam bentuknya, juga disebut nukleus berbentuk ginjal; (7) sel berlobulus: sel dengan tonjolan inti lebih besar dari vesikel yang disebutkan sebelumnya; dan (8) sel mikro: sel dengan inti terkondensasi dan sitoplasma berkurang. Perubahan tersebut dibandingkan dengan hasil kontrol negatif.
Hasil uji toksisitas akut (LC50) dianalisis menggunakan perangkat lunak GBasic dan metode TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Data uji kronis diuji terlebih dahulu untuk mengetahui kenormalan galat (Shapiro-Wilks) dan homogenitas varians (Bartlett). Hasilnya dianalisis menggunakan analisis varians satu arah (ANOVA). Uji Tukey digunakan untuk membandingkan data di antara mereka sendiri, dan uji Dunnett digunakan untuk membandingkan data antara kelompok perlakuan dan kelompok kontrol negatif.
Data LOEC dan NOEC dianalisis menggunakan uji Dunnett. Uji statistik dilakukan menggunakan perangkat lunak Statistica 8.0 (StatSoft) dengan tingkat signifikansi 95% (p < 0,05).
Waktu posting: 13-Mar-2025