Distribusi curah hujan musiman di Provinsi Guizhou tidak merata, dengan curah hujan lebih banyak di musim semi dan musim panas, tetapi bibit rapeseed rentan terhadap stres kekeringan di musim gugur dan musim dingin, yang sangat memengaruhi hasil panen. Sawi adalah tanaman penghasil minyak khusus yang terutama ditanam di Provinsi Guizhou. Tanaman ini memiliki toleransi kekeringan yang kuat dan dapat ditanam di daerah pegunungan. Sawi merupakan sumber daya gen tahan kekeringan yang kaya. Penemuan gen tahan kekeringan sangat penting untuk peningkatan varietas sawi dan inovasi dalam sumber daya plasma nutfah. Keluarga GRF memainkan peran penting dalam pertumbuhan dan perkembangan tanaman serta respons terhadap stres kekeringan. Saat ini, gen GRF telah ditemukan pada Arabidopsis 2, padi (Oryza sativa) 12, rapeseed 13, kapas (Gossypium hirsutum) 14, gandum (Triticum aestivum) 15, millet mutiara (Setaria italica) 16 dan Brassica 17, tetapi belum ada laporan tentang gen GRF yang terdeteksi pada sawi. Dalam penelitian ini, gen keluarga GRF pada sawi diidentifikasi pada tingkat genomik dan karakteristik fisik dan kimianya, hubungan evolusioner, homologi, motif yang terkonservasi, struktur gen, duplikasi gen, elemen cis, dan tahap bibit (tahap empat daun) dianalisis. Pola ekspresi di bawah tekanan kekeringan dianalisis secara komprehensif untuk memberikan dasar ilmiah bagi studi lebih lanjut tentang potensi fungsi gen BjGRF dalam respons terhadap kekeringan dan untuk menyediakan gen kandidat untuk pemuliaan sawi yang tahan kekeringan.
Tiga puluh empat gen BjGRF diidentifikasi dalam genom Brassica juncea menggunakan dua pencarian HMMER, yang semuanya mengandung domain QLQ dan WRC. Urutan CDS dari gen BjGRF yang diidentifikasi disajikan dalam Tabel Tambahan S1. BjGRF01–BjGRF34 diberi nama berdasarkan lokasinya pada kromosom. Sifat fisikokimia keluarga ini menunjukkan bahwa panjang asam amino sangat bervariasi, berkisar dari 261 aa (BjGRF19) hingga 905 aa (BjGRF28). Titik isoelektrik BjGRF berkisar dari 6,19 (BjGRF02) hingga 9,35 (BjGRF03) dengan rata-rata 8,33, dan 88,24% BjGRF adalah protein basa. Kisaran berat molekuler BjGRF yang diprediksi adalah dari 29,82 kDa (BjGRF19) hingga 102,90 kDa (BjGRF28); indeks ketidakstabilan protein BjGRF berkisar dari 51,13 (BjGRF08) hingga 78,24 (BjGRF19), semuanya lebih besar dari 40, menunjukkan bahwa indeks asam lemak berkisar dari 43,65 (BjGRF01) hingga 78,78 (BjGRF22), hidrofilisitas rata-rata (GRAVY) berkisar dari -1,07 (BjGRF31) hingga -0,45 (BjGRF22), semua protein BjGRF hidrofilik memiliki nilai GRAVY negatif, yang mungkin disebabkan oleh kurangnya hidrofobisitas yang disebabkan oleh residu. Prediksi lokalisasi subseluler menunjukkan bahwa 31 protein yang dikodekan oleh BjGRF dapat terlokalisasi di nukleus, BjGRF04 dapat terlokalisasi di peroksisom, BjGRF25 dapat terlokalisasi di sitoplasma, dan BjGRF28 dapat terlokalisasi di kloroplas (Tabel 1), yang mengindikasikan bahwa BjGRF mungkin terlokalisasi di nukleus dan memainkan peran pengaturan penting sebagai faktor transkripsi.
Analisis filogenetik famili GRF pada spesies yang berbeda dapat membantu mempelajari fungsi gen. Oleh karena itu, sekuens asam amino lengkap dari 35 GRF rapeseed, 16 GRF lobak, 12 GRF padi, 10 GRF millet, dan 9 GRF Arabidopsis diunduh dan pohon filogenetik dibangun berdasarkan 34 gen BjGRF yang teridentifikasi (Gambar 1). Ketiga subfamili tersebut mengandung jumlah anggota yang berbeda; 116 GRF TF dibagi menjadi tiga subfamili berbeda (kelompok A~C), yang masing-masing mengandung 59% (50,86%), 34% (29,31%), dan 23% (19,83%) dari GRF. Di antara mereka, 34 anggota famili BjGRF tersebar di 3 subfamili: 13 anggota di kelompok A (38,24%), 12 anggota di kelompok B (35,29%), dan 9 anggota di kelompok C (26,47%). Dalam proses poliploidisasi sawi, jumlah gen BjGRF pada subfamili yang berbeda juga berbeda, dan kemungkinan terjadi amplifikasi dan kehilangan gen. Perlu dicatat bahwa tidak ada distribusi GRF padi dan millet pada kelompok C, sedangkan terdapat 2 GRF padi dan 1 GRF millet pada kelompok B, dan sebagian besar GRF padi dan millet dikelompokkan dalam satu cabang, menunjukkan bahwa BjGRF sangat terkait dengan tumbuhan dikotil. Di antara studi-studi tersebut, penelitian paling mendalam tentang fungsi GRF pada Arabidopsis thaliana memberikan dasar untuk studi fungsional BjGRF.
Pohon filogenetik tanaman sawi termasuk Brassica napus, Brassica napus, padi, millet dan anggota keluarga Arabidopsis thaliana GRF.
Analisis gen berulang dalam famili GRF pada tanaman sawi. Garis abu-abu di latar belakang mewakili blok yang tersinkronisasi dalam genom sawi, garis merah mewakili sepasang pengulangan tersegmentasi dari gen BjGRF;
Ekspresi gen BjGRF di bawah tekanan kekeringan pada tahap daun keempat. Data qRT-PCR ditunjukkan pada Tabel Tambahan S5. Perbedaan signifikan dalam data ditunjukkan oleh huruf kecil.
Seiring dengan terus berubahnya iklim global, mempelajari bagaimana tanaman mengatasi stres kekeringan dan meningkatkan mekanisme toleransinya telah menjadi topik penelitian yang hangat18. Setelah kekeringan, struktur morfologi, ekspresi gen, dan proses metabolisme tanaman akan berubah, yang dapat menyebabkan penghentian fotosintesis dan gangguan metabolisme, yang memengaruhi hasil dan kualitas tanaman19,20,21. Ketika tanaman merasakan sinyal kekeringan, mereka menghasilkan pembawa pesan kedua seperti Ca2+ dan fosfatidilinositol, meningkatkan konsentrasi ion kalsium intraseluler dan mengaktifkan jaringan pengaturan jalur fosforilasi protein22,23. Protein target akhir secara langsung terlibat dalam pertahanan seluler atau mengatur ekspresi gen stres terkait melalui TF, meningkatkan toleransi tanaman terhadap stres24,25. Dengan demikian, TF memainkan peran penting dalam menanggapi stres kekeringan. Menurut urutan dan sifat pengikatan DNA dari TF responsif terhadap stres kekeringan, TF dapat dibagi menjadi beberapa famili, seperti GRF, ERF, MYB, WRKY, dan famili lainnya26.
Keluarga gen GRF adalah jenis TF spesifik tanaman yang memainkan peran penting dalam berbagai aspek seperti pertumbuhan, perkembangan, transduksi sinyal, dan respons pertahanan tanaman27. Sejak gen GRF pertama diidentifikasi pada O. sativa28, semakin banyak gen GRF yang diidentifikasi pada banyak spesies dan terbukti memengaruhi pertumbuhan, perkembangan, dan respons stres tanaman8, 29, 30,31,32. Dengan publikasi sekuens genom Brassica juncea, identifikasi keluarga gen BjGRF menjadi mungkin33. Dalam penelitian ini, 34 gen BjGRF diidentifikasi dalam keseluruhan genom sawi dan diberi nama BjGRF01–BjGRF34 berdasarkan posisi kromosomnya. Semuanya mengandung domain QLQ dan WRC yang sangat terkonservasi. Analisis sifat fisikokimia menunjukkan bahwa perbedaan jumlah asam amino dan berat molekul protein BjGRF (kecuali BjGRF28) tidak signifikan, menunjukkan bahwa anggota keluarga BjGRF mungkin memiliki fungsi yang serupa. Analisis struktur gen menunjukkan bahwa 64,7% gen BjGRF mengandung 4 ekson, yang mengindikasikan bahwa struktur gen BjGRF relatif terkonservasi dalam evolusi, tetapi jumlah ekson pada gen BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28, dan BjGRF29 lebih besar. Studi telah menunjukkan bahwa penambahan atau penghapusan ekson atau intron dapat menyebabkan perbedaan dalam struktur dan fungsi gen, sehingga menciptakan gen baru34,35,36. Oleh karena itu, kami berspekulasi bahwa intron BjGRF hilang selama evolusi, yang dapat menyebabkan perubahan fungsi gen. Konsisten dengan studi yang ada, kami juga menemukan bahwa jumlah intron berhubungan dengan ekspresi gen. Ketika jumlah intron dalam suatu gen besar, gen tersebut dapat dengan cepat merespons berbagai faktor yang tidak menguntungkan.
Duplikasi gen merupakan faktor utama dalam evolusi genomik dan genetik37. Studi terkait telah menunjukkan bahwa duplikasi gen tidak hanya meningkatkan jumlah gen GRF, tetapi juga berfungsi sebagai sarana untuk menghasilkan gen baru guna membantu tanaman beradaptasi dengan berbagai kondisi lingkungan yang merugikan38. Sebanyak 48 pasang gen duplikat ditemukan dalam penelitian ini, yang semuanya merupakan duplikasi segmental, menunjukkan bahwa duplikasi segmental adalah mekanisme utama untuk meningkatkan jumlah gen dalam famili ini. Telah dilaporkan dalam literatur bahwa duplikasi segmental dapat secara efektif mendorong amplifikasi anggota famili gen GRF pada Arabidopsis dan stroberi, dan tidak ditemukan duplikasi tandem dari famili gen ini pada spesies mana pun27,39. Hasil penelitian ini konsisten dengan studi yang ada pada famili Arabidopsis thaliana dan stroberi, menunjukkan bahwa famili GRF dapat meningkatkan jumlah gen dan menghasilkan gen baru melalui duplikasi segmental pada berbagai tanaman.
Dalam penelitian ini, total 34 gen BjGRF diidentifikasi pada tanaman sawi, yang terbagi menjadi 3 subfamili. Gen-gen ini menunjukkan motif dan struktur gen yang serupa dan terkonservasi. Analisis kolinearitas mengungkapkan 48 pasang duplikasi segmen pada sawi. Daerah promotor BjGRF mengandung elemen cis-acting yang terkait dengan respons cahaya, respons hormonal, respons stres lingkungan, serta pertumbuhan dan perkembangan. Ekspresi 34 gen BjGRF dideteksi pada tahap bibit sawi (akar, batang, daun), dan pola ekspresi 10 gen BjGRF di bawah kondisi kekeringan. Ditemukan bahwa pola ekspresi gen BjGRF di bawah stres kekeringan serupa dan mungkin memiliki keterlibatan yang sama dalam regulasi pemaksaan kekeringan. Gen BjGRF03 dan BjGRF32 mungkin memainkan peran regulasi positif dalam stres kekeringan, sedangkan BjGRF06 dan BjGRF23 berperan dalam stres kekeringan sebagai gen target miR396. Secara keseluruhan, penelitian kami memberikan dasar biologis untuk penemuan fungsi gen BjGRF di masa mendatang pada tanaman famili Brassicaceae.
Benih sawi yang digunakan dalam percobaan ini disediakan oleh Institut Penelitian Benih Minyak Guizhou, Akademi Ilmu Pertanian Guizhou. Pilih benih utuh dan tanam di tanah (substrat: tanah = 3:1), dan kumpulkan akar, batang, dan daun setelah tahap empat daun. Tanaman diberi perlakuan dengan 20% PEG 6000 untuk mensimulasikan kekeringan, dan daun dikumpulkan setelah 0, 3, 6, 12, dan 24 jam. Semua sampel tanaman segera dibekukan dalam nitrogen cair dan kemudian disimpan dalam freezer -80°C untuk pengujian selanjutnya.
Semua data yang diperoleh atau dianalisis selama penelitian ini disertakan dalam artikel yang diterbitkan dan file informasi tambahan.
Waktu posting: 22 Januari 2025