Nematoda pinus merupakan endoparasit migrasi karantina yang diketahui menyebabkan kerugian ekonomi yang parah pada ekosistem hutan pinus. Studi saat ini mengulas aktivitas nematisida indol terhalogenasi terhadap nematoda pinus dan mekanisme kerjanya. Aktivitas nematisida 5-iodoindol dan avermectin (kontrol positif) terhadap nematoda pinus serupa dan tinggi pada konsentrasi rendah (10 μg/mL). 5-iodoindol mengurangi kesuburan, aktivitas reproduksi, mortalitas embrio dan larva, serta perilaku lokomotor. Interaksi molekuler ligan dengan reseptor saluran klorida berpagar glutamat spesifik invertebrata mendukung gagasan bahwa 5-iodoindol, seperti avermectin, mengikat erat ke situs aktif reseptor. 5-Iodoindol juga menginduksi berbagai deformasi fenotipik pada nematoda, termasuk kolaps/penyusutan organ abnormal dan peningkatan vakuolisasi. Hasil ini menunjukkan bahwa vakuola mungkin berperan dalam kematian yang dimediasi oleh metilasi nematoda. Yang penting, 5-iodoindole tidak beracun bagi kedua spesies tanaman (kubis dan lobak). Dengan demikian, penelitian ini menunjukkan bahwa aplikasi iodoindole dalam kondisi lingkungan dapat mengendalikan kerusakan akibat layu pada tanaman pinus.
Nematoda kayu pinus (Bursaphelenchus xylophilus) termasuk dalam nematoda kayu pinus (PWN), nematoda endoparasit migrasi yang diketahui menyebabkan kerusakan ekologis yang parah pada ekosistem hutan pinus1. Penyakit layu pinus (PWD) yang disebabkan oleh nematoda kayu pinus menjadi masalah serius di beberapa benua, termasuk Asia dan Eropa, dan di Amerika Utara, nematoda tersebut menghancurkan spesies pinus yang diperkenalkan1,2. Penurunan pohon pinus merupakan masalah ekonomi utama, dan prospek penyebaran globalnya mengkhawatirkan3. Spesies pinus berikut ini paling sering diserang oleh nematoda: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii, dan Pinus radiata4. Nematoda pinus merupakan penyakit serius yang dapat membunuh pohon pinus dalam beberapa minggu atau bulan setelah infeksi. Selain itu, wabah nematoda pinus umum terjadi di berbagai ekosistem, sehingga rantai infeksi persisten telah terbentuk1.
Bursaphelenchus xylophilus adalah nematoda parasit tumbuhan karantina yang termasuk dalam superfamili Aphelenchoidea dan klad 102.5. Nematoda ini memakan jamur dan bereproduksi di jaringan kayu pohon pinus, berkembang menjadi empat tahap larva yang berbeda: L1, L2, L3, L4 dan individu dewasa1,6. Dalam kondisi kekurangan pangan, nematoda pinus masuk ke tahap larva khusus – dauer, yang menjadi parasit bagi vektornya – kumbang kulit kayu pinus (Monochamus alternatus) dan dipindahkan ke pohon pinus yang sehat. Pada inang yang sehat, nematoda dengan cepat bermigrasi melalui jaringan tanaman dan memakan sel parenkim, yang menyebabkan sejumlah reaksi hipersensitivitas, layu pinus dan kematian dalam waktu satu tahun setelah infeksi1,7,8.
Pengendalian hayati nematoda pinus telah lama menjadi tantangan, dengan tindakan karantina yang dimulai sejak abad ke-20. Strategi pengendalian nematoda pinus saat ini terutama melibatkan perawatan kimia, termasuk pengasapan kayu dan penanaman nematisida ke batang pohon. Nematisida yang paling umum digunakan adalah avermectin dan avermectin benzoate, yang termasuk dalam famili avermectin. Bahan kimia mahal ini sangat efektif terhadap banyak spesies nematoda dan dianggap aman bagi lingkungan9. Namun, penggunaan nematisida ini secara berulang diperkirakan akan menciptakan tekanan seleksi yang hampir pasti akan menyebabkan munculnya nematoda pinus yang resistan, seperti yang telah ditunjukkan pada beberapa hama serangga, seperti Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella dan nematoda Trichostrongylus colubriformis dan Ostertagia circumcincta, yang secara bertahap telah mengembangkan resistensi terhadap avermectin10,11,12. Oleh karena itu, pola resistensi perlu dipelajari secara berkala dan nematisida harus disaring secara terus-menerus untuk menemukan cara alternatif yang hemat biaya dan ramah lingkungan untuk mengendalikan PVD. Dalam beberapa dekade terakhir, sejumlah penulis telah mengusulkan penggunaan ekstrak tanaman, minyak atsiri, dan zat volatil sebagai agen pengendali nematoda13,14,15,16.
Kami baru-baru ini menunjukkan aktivitas nematisida indole, molekul pensinyalan antarsel dan antarkerajaan, dalam Caenorhabditis elegans 17 . Indole adalah sinyal intraseluler yang tersebar luas dalam ekologi mikroba, mengendalikan banyak fungsi yang memengaruhi fisiologi mikroba, pembentukan spora, stabilitas plasmid, resistensi obat, pembentukan biofilm, dan virulensi 18, 19 . Aktivitas indole dan turunannya terhadap nematoda patogen lainnya belum dipelajari. Dalam penelitian ini, kami menyelidiki aktivitas nematisida dari 34 indole terhadap nematoda pinus dan menjelaskan mekanisme kerja 5-iodoindole yang paling kuat menggunakan mikroskopi, fotografi selang waktu, dan eksperimen docking molekuler, dan menilai efek toksiknya pada tanaman menggunakan uji perkecambahan biji.
Konsentrasi tinggi (>1,0 mM) indole sebelumnya telah dilaporkan memiliki efek nematisida pada nematoda17. Setelah pengobatan B. xylophilus (tahap kehidupan campuran) dengan indole atau 33 turunan indole yang berbeda pada 1 mM, mortalitas B. xylophilus diukur dengan menghitung nematoda hidup dan mati pada kelompok kontrol dan kelompok yang diobati. Lima indole menunjukkan aktivitas nematisida yang signifikan; kelangsungan hidup kelompok kontrol yang tidak diobati adalah 95 ± 7% setelah 24 jam. Dari 34 indole yang diuji, 5-iodoindol dan 4-fluoroindol pada 1 mM menyebabkan mortalitas 100%, sedangkan 5,6-difluoroindigo, methylindole-7-carboxylate, dan 7-iodoindol menyebabkan mortalitas sekitar 50% (Tabel 1).
Efek 5-iodoindole pada pembentukan vakuola dan metabolisme nematoda kayu pinus. (A) Efek avermectin dan 5-iodoindole pada nematoda jantan dewasa, (B) Telur nematoda stadium L1 dan (C) metabolisme B. xylophilus, (i) vakuola tidak diamati pada jam ke-0, pengobatan mengakibatkan (ii) vakuola, (iii) akumulasi beberapa vakuola, (iv) pembengkakan vakuola, (v) fusi vakuola dan (vi) pembentukan vakuola raksasa. Panah merah menunjukkan pembengkakan vakuola, panah biru menunjukkan fusi vakuola dan panah hitam menunjukkan vakuola raksasa. Skala batang = 50 μm.
Selain itu, penelitian ini juga menggambarkan proses berurutan kematian yang diinduksi metana pada nematoda pinus (Gambar 4C). Kematian metanogenik adalah jenis kematian sel non-apoptotik yang terkait dengan akumulasi vakuola sitoplasma yang menonjol27. Cacat morfologi yang diamati pada nematoda pinus tampaknya terkait erat dengan mekanisme kematian yang diinduksi metana. Pemeriksaan mikroskopis pada waktu yang berbeda menunjukkan bahwa vakuola raksasa terbentuk setelah 20 jam paparan 5-iodoindol (0,1 mM). Vakuola mikroskopis diamati setelah 8 jam pengobatan, dan jumlahnya meningkat setelah 12 jam. Beberapa vakuola besar diamati setelah 14 jam. Beberapa vakuola yang menyatu terlihat jelas setelah 12–16 jam pengobatan, yang menunjukkan bahwa fusi vakuola adalah dasar dari mekanisme kematian metanogenik. Setelah 20 jam, beberapa vakuola raksasa ditemukan di seluruh cacing. Pengamatan ini merupakan laporan pertama metuosis pada C. elegans.
Pada cacing yang diberi perlakuan 5-iodoindole, agregasi dan ruptur vakuola juga diamati (Gbr. 5), sebagaimana dibuktikan oleh pembengkokan cacing dan pelepasan vakuola ke lingkungan. Gangguan vakuola juga diamati pada membran kulit telur, yang biasanya diawetkan utuh oleh L2 selama penetasan (Gambar Tambahan S2). Pengamatan ini mendukung keterlibatan akumulasi cairan dan kegagalan osmoregulasi, serta cedera sel reversibel (RCI), dalam proses pembentukan dan supurasi vakuola (Gbr. 5).
Dengan berhipotesis tentang peran yodium dalam pembentukan vakuola yang diamati, kami menyelidiki aktivitas nematisida natrium iodida (NaI) dan kalium iodida (KI). Namun, pada konsentrasi (0,1, 0,5 atau 1 mM), mereka tidak memengaruhi kelangsungan hidup nematoda atau pembentukan vakuola (Gambar Tambahan S5), meskipun KI 1 mM memiliki sedikit efek nematisida. Di sisi lain, 7-iodoindol (1 atau 2 mM), seperti 5-iodoindol, menginduksi beberapa vakuola dan deformasi struktural (Gambar Tambahan S6). Kedua iodoindol menunjukkan karakteristik fenotipik yang serupa pada nematoda pinus, sedangkan NaI dan KI tidak. Menariknya, indol tidak menginduksi pembentukan vakuola pada B. xylophilus pada konsentrasi yang diuji (data tidak ditampilkan). Dengan demikian, hasil tersebut menegaskan bahwa kompleks indol-iodin bertanggung jawab atas vakuolisasi dan metabolisme B. xylophilus.
Di antara indole yang diuji untuk aktivitas nematisida, 5-iodoindol memiliki indeks slip tertinggi sebesar -5,89 kkal/mol, diikuti oleh 7-iodoindol (-4,48 kkal/mol), 4-fluoroindol (-4,33), dan indole (-4,03) ( Gambar 6 ). Ikatan hidrogen yang kuat antara 5-iodoindol dengan leusin 218 menstabilkan ikatannya, sedangkan semua turunan indole lainnya berikatan dengan serin 260 melalui ikatan hidrogen rantai samping. Di antara iodoindol lain yang dimodelkan, 2-iodoindol memiliki nilai pengikatan sebesar -5,248 kkal/mol, yang disebabkan oleh ikatan hidrogen utamanya dengan leusin 218. Pengikatan lain yang diketahui meliputi 3-iodoindol (-4,3 kkal/mol), 4-iodoindol (-4,0 kkal/mol), dan 6-fluoroindol (-2,6 kkal/mol) (Gambar Tambahan S8). Sebagian besar indole terhalogenasi dan indole itu sendiri, dengan pengecualian 5-iodoindol dan 2-iodoindol, membentuk ikatan dengan serin 260. Fakta bahwa ikatan hidrogen dengan leusin 218 menunjukkan pengikatan reseptor-ligan yang efisien, seperti yang diamati untuk ivermectin (Gambar Tambahan S7), menegaskan bahwa 5-iodoindol dan 2-iodoindol, seperti ivermectin, mengikat erat ke situs aktif reseptor GluCL melalui leusin 218 (Gambar 6 dan Gambar Tambahan S8). Kami mengusulkan bahwa pengikatan ini diperlukan untuk mempertahankan struktur pori terbuka kompleks GluCL dan bahwa dengan mengikat erat ke situs aktif reseptor GluCL, 5-iodoindol, 2-iodoindol, avermectin dan ivermectin dengan demikian mempertahankan saluran ion terbuka dan memungkinkan penyerapan cairan.
Docking molekular indole dan indole terhalogenasi ke GluCL. Orientasi pengikatan ligan (A) indole, (B) 4-fluoroindole, (C) 7-iodoindole, dan (D) 5-iodoindole ke situs aktif GluCL. Protein diwakili oleh pita, dan ikatan hidrogen tulang punggung ditunjukkan sebagai garis putus-putus berwarna kuning. (A′), (B′), (C′), dan (D′) menunjukkan interaksi ligan yang sesuai dengan residu asam amino di sekitarnya, dan ikatan hidrogen rantai samping ditunjukkan oleh panah putus-putus berwarna merah muda.
Percobaan dilakukan untuk mengevaluasi efek toksik 5-iodoindole pada perkecambahan benih kubis dan lobak. 5-iodoindole (0,05 atau 0,1 mM) atau avermectin (10 μg/mL) memiliki sedikit atau tidak ada efek pada perkecambahan awal dan kemunculan planlet (Gambar 7). Selain itu, tidak ditemukan perbedaan signifikan antara laju perkecambahan kontrol yang tidak diobati dan benih yang diobati dengan 5-iodoindole atau avermectin. Efek pada pemanjangan akar tunggang dan jumlah akar lateral yang terbentuk tidak signifikan, meskipun 1 mM (10 kali konsentrasi aktifnya) 5-iodoindole sedikit menunda perkembangan akar lateral. Hasil ini menunjukkan bahwa 5-iodoindole tidak beracun bagi sel tanaman dan tidak mengganggu proses perkembangan tanaman pada konsentrasi yang dipelajari.
Efek 5-iodoindole pada perkecambahan biji. Perkecambahan, perkecambahan, dan perakaran lateral biji B. oleracea dan R. raphanistrum pada media agar Murashige dan Skoog dengan atau tanpa avermectin atau 5-iodoindole. Perkecambahan dicatat setelah 3 hari inkubasi pada suhu 22°C.
Studi ini melaporkan beberapa kasus pembunuhan nematoda oleh indoles. Yang penting, ini adalah laporan pertama tentang iodoindol yang menginduksi metilasi (proses yang disebabkan oleh akumulasi vakuola kecil yang secara bertahap bergabung menjadi vakuola raksasa, yang akhirnya menyebabkan pecahnya membran dan kematian) pada jarum pinus, dengan iodoindol yang menunjukkan sifat nematisida yang signifikan mirip dengan nematisida komersial avermectin.
Indoles sebelumnya telah dilaporkan memiliki beberapa fungsi pensinyalan pada prokariota dan eukariota, termasuk penghambatan/pembentukan biofilm, kelangsungan hidup bakteri, dan patogenisitas19,32,33,34. Baru-baru ini, potensi efek terapeutik dari indol terhalogenasi, alkaloid indol, dan turunan indol semisintetik telah menarik minat penelitian yang luas35,36,37. Misalnya, indol terhalogenasi telah terbukti membunuh sel Escherichia coli dan Staphylococcus aureus yang persisten37. Selain itu, merupakan kepentingan ilmiah untuk mempelajari kemanjuran indol terhalogenasi terhadap spesies, genus, dan kerajaan lain, dan penelitian ini merupakan langkah menuju pencapaian tujuan ini.
Di sini, kami mengusulkan mekanisme kematian yang diinduksi 5-iodoindole pada C. elegans berdasarkan cedera sel reversibel (RCI) dan metilasi (Gambar 4C dan 5). Perubahan edema seperti bengkak dan degenerasi vakuola merupakan indikator RCI dan metilasi, yang terwujud sebagai vakuola raksasa dalam sitoplasma48,49. RCI mengganggu produksi energi dengan mengurangi produksi ATP, menyebabkan kegagalan pompa ATPase, atau mengganggu membran sel dan menyebabkan masuknya Na+, Ca2+, dan air secara cepat50,51,52. Vakuola intrasitoplasma muncul dalam sel hewan sebagai akibat dari akumulasi cairan dalam sitoplasma akibat masuknya Ca2+ dan air53. Menariknya, mekanisme kerusakan sel ini bersifat reversibel jika kerusakannya bersifat sementara dan sel-sel mulai memproduksi ATP selama jangka waktu tertentu, tetapi jika kerusakan berlanjut atau memburuk, sel-sel tersebut mati.54 Pengamatan kami menunjukkan bahwa nematoda yang diobati dengan 5-iodoindole tidak dapat memulihkan biosintesis normal setelah terpapar kondisi stres.
Fenotipe metilasi yang diinduksi oleh 5-iodoindol pada B. xylophilus mungkin disebabkan oleh keberadaan yodium dan distribusi molekulernya, karena 7-iodoindol memiliki efek penghambatan yang lebih sedikit pada B. xylophilus daripada 5-iodoindol (Tabel 1 dan Gambar Tambahan S6). Hasil ini sebagian konsisten dengan penelitian Maltese et al. (2014), yang melaporkan bahwa translokasi gugus nitrogen piridil dalam indol dari posisi para- ke meta- menghapuskan vakuolisasi, penghambatan pertumbuhan, dan sitotoksisitas pada sel U251, yang menunjukkan bahwa interaksi molekul dengan situs aktif spesifik dalam protein sangat penting27,44,45. Interaksi antara indol atau indol terhalogenasi dan reseptor GluCL yang diamati dalam penelitian ini juga mendukung gagasan ini, karena 5- dan 2-iodoindol ditemukan mengikat reseptor GluCL lebih kuat daripada indol lain yang diperiksa (Gambar 6 dan Gambar Tambahan S8). Iodium pada posisi kedua atau kelima indol diketahui mengikat leusin 218 dari reseptor GluCL melalui ikatan hidrogen utama, sedangkan indol terhalogenasi lainnya dan indol itu sendiri membentuk ikatan hidrogen rantai samping yang lemah dengan serin 260 (Gambar 6). Oleh karena itu, kami berspekulasi bahwa lokalisasi halogen memainkan peran penting dalam induksi degenerasi vakuola, sedangkan pengikatan ketat 5-iodoindole menjaga saluran ion tetap terbuka, sehingga memungkinkan masuknya cairan dengan cepat dan pecahnya vakuola. Namun, mekanisme kerja 5-iodoindole secara terperinci masih harus ditentukan.
Sebelum penerapan praktis 5-iodoindole, efek toksiknya pada tanaman harus dianalisis. Percobaan perkecambahan biji kami menunjukkan bahwa 5-iodoindole tidak memiliki efek negatif pada perkecambahan biji atau proses perkembangan selanjutnya pada konsentrasi yang diteliti (Gambar 7). Dengan demikian, penelitian ini memberikan dasar untuk penggunaan 5-iodoindole di lingkungan ekologis guna mengendalikan bahaya nematoda pinus terhadap pohon pinus.
Laporan sebelumnya telah menunjukkan bahwa terapi berbasis indole merupakan pendekatan potensial untuk mengatasi masalah resistensi antibiotik dan perkembangan kanker55. Selain itu, indole memiliki aktivitas antibakteri, antikanker, antioksidan, antiradang, antidiabetik, antivirus, antiproliferatif, dan antituberkulosis dan dapat menjadi dasar yang menjanjikan untuk pengembangan obat56,57. Studi ini untuk pertama kalinya menunjukkan potensi penggunaan yodium sebagai agen antiparasit dan anthelmintik.
Avermectin ditemukan tiga dekade lalu dan memenangkan Penghargaan Nobel pada tahun 2015, dan penggunaannya sebagai anthelmintik masih terus berlangsung. Namun, karena perkembangan resistensi yang cepat terhadap avermectin pada nematoda dan hama serangga, diperlukan strategi alternatif yang murah dan ramah lingkungan untuk mengendalikan infeksi PWN pada pohon pinus. Studi ini juga melaporkan mekanisme yang digunakan 5-iodoindole untuk membunuh nematoda pinus dan bahwa 5-iodoindole memiliki toksisitas rendah terhadap sel tanaman, yang membuka prospek yang baik untuk aplikasi komersialnya di masa mendatang.
Semua percobaan disetujui oleh Komite Etik Universitas Yeungnam, Gyeongsan, Korea, dan metode dilakukan sesuai dengan pedoman Komite Etik Universitas Yeungnam.
Percobaan inkubasi telur dilakukan dengan menggunakan prosedur yang telah ditetapkan43. Untuk menilai tingkat penetasan (HR), nematoda dewasa berumur 1 hari (sekitar 100 betina dan 100 jantan) dipindahkan ke cawan Petri yang berisi jamur dan dibiarkan tumbuh selama 24 jam. Telur kemudian diisolasi dan diobati dengan 5-iodoindol (0,05 mM dan 0,1 mM) atau avermectin (10 μg/ml) sebagai suspensi dalam air suling steril. Suspensi ini (500 μl; sekitar 100 telur) dipindahkan ke sumur pelat kultur jaringan 24 sumur dan diinkubasi pada suhu 22 °C. Hitungan L2 dilakukan setelah 24 jam inkubasi tetapi dianggap mati jika sel tidak bergerak saat distimulasi dengan kawat platina halus. Percobaan ini dilakukan dalam dua tahap, masing-masing dengan enam kali pengulangan. Data dari kedua percobaan digabungkan dan disajikan. Persentase HR dihitung sebagai berikut:
Mortalitas larva dinilai menggunakan prosedur yang telah dikembangkan sebelumnya. Telur nematoda dikumpulkan dan embrio disinkronkan dengan menetaskannya dalam air suling steril untuk menghasilkan larva stadium L2. Larva yang disinkronkan (sekitar 500 nematoda) diobati dengan 5-iodoindol (0,05 mM dan 0,1 mM) atau avermectin (10 μg/ml) dan dibesarkan pada cawan Petri B. cinerea. Setelah 48 jam inkubasi pada suhu 22 °C, nematoda dikumpulkan dalam air suling steril dan diperiksa untuk mengetahui keberadaan stadium L2, L3, dan L4. Keberadaan stadium L3 dan L4 menunjukkan transformasi larva, sedangkan keberadaan stadium L2 menunjukkan tidak adanya transformasi. Gambar diperoleh menggunakan Sistem Pencitraan Sel Digital iRiS™. Percobaan ini dilakukan dalam dua tahap, masing-masing dengan enam kali pengulangan. Data dari kedua percobaan digabungkan dan disajikan.
Toksisitas 5-iodoindole dan avermectin terhadap benih dinilai menggunakan uji perkecambahan pada pelat agar Murashige dan Skoog.62 Benih B. oleracea dan R. raphanistrum pertama-tama direndam dalam air suling steril selama satu hari, dicuci dengan 1 ml etanol 100%, disterilkan dengan 1 ml pemutih komersial 50% (natrium hipoklorit 3%) selama 15 menit, dan dicuci lima kali dengan 1 ml air steril. Benih yang disterilkan kemudian ditekan ke pelat agar perkecambahan yang berisi media Murashige dan Skoog 0,86 g/l (0,2X) dan agar bakteriologis 0,7% dengan atau tanpa 5-iodoindole atau avermectin. Pelat kemudian diinkubasi pada suhu 22 °C, dan gambar diambil setelah 3 hari inkubasi. Percobaan ini dilakukan dalam dua tahap, yang masing-masing memiliki enam pengulangan.
Waktu posting: 26-Feb-2025