Nematoda pinus merupakan endoparasit migrasi karantina yang diketahui menyebabkan kerugian ekonomi yang parah pada ekosistem hutan pinus. Penelitian ini mengkaji aktivitas nematisida indol terhalogenasi terhadap nematoda pinus dan mekanisme kerjanya. Aktivitas nematisida 5-iodoindol dan avermectin (kontrol positif) terhadap nematoda pinus serupa dan tinggi pada konsentrasi rendah (10 μg/mL). 5-iodoindol menurunkan fekunditas, aktivitas reproduksi, mortalitas embrio dan larva, serta perilaku lokomotor. Interaksi molekuler ligan dengan reseptor saluran klorida bergerbang glutamat spesifik invertebrata mendukung gagasan bahwa 5-iodoindol, seperti avermectin, berikatan erat dengan situs aktif reseptor. 5-Iodoindol juga menginduksi berbagai deformasi fenotipik pada nematoda, termasuk kolaps/penyusutan organ abnormal dan peningkatan vakuolisasi. Hasil ini menunjukkan bahwa vakuola mungkin berperan dalam kematian yang dimediasi oleh metilasi nematoda. Yang penting, 5-iodoindol tidak beracun bagi kedua spesies tanaman (kubis dan lobak). Dengan demikian, penelitian ini menunjukkan bahwa aplikasi iodoindol dalam kondisi lingkungan dapat mengendalikan kerusakan akibat layu pinus.
Nematoda kayu pinus (Bursaphelenchus xylophilus) termasuk dalam nematoda kayu pinus (PWN), nematoda endoparasit migrasi yang diketahui menyebabkan kerusakan ekologis yang parah pada ekosistem hutan pinus.1 Penyakit layu pinus (PWD) yang disebabkan oleh nematoda kayu pinus menjadi masalah serius di beberapa benua, termasuk Asia dan Eropa, dan di Amerika Utara, nematoda ini menghancurkan spesies pinus yang diintroduksi.1,2 Penurunan populasi pohon pinus merupakan masalah ekonomi yang besar, dan prospek penyebarannya secara global mengkhawatirkan.3 Spesies pinus berikut paling sering diserang oleh nematoda ini: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii, dan Pinus radiata.4 Nematoda pinus merupakan penyakit serius yang dapat membunuh pohon pinus dalam beberapa minggu atau bulan setelah infeksi. Selain itu, wabah nematoda pinus umum terjadi di berbagai ekosistem, sehingga rantai infeksi yang persisten telah terbentuk.1
Bursaphelenchus xylophilus adalah nematoda parasit tumbuhan karantina yang termasuk dalam superfamili Aphelenchoidea dan klad 102.5. Nematoda ini memakan jamur dan bereproduksi di jaringan kayu pohon pinus, berkembang menjadi empat stadium larva yang berbeda: L1, L2, L3, L4, dan individu dewasa1,6. Dalam kondisi kekurangan pangan, nematoda pinus memasuki stadium larva khusus – dauer, yang menjadi parasit bagi vektornya – kumbang kulit kayu pinus (Monochamus alternatus) dan ditularkan ke pohon pinus yang sehat. Pada inang yang sehat, nematoda dengan cepat bermigrasi melalui jaringan tanaman dan memakan sel parenkim, yang menyebabkan sejumlah reaksi hipersensitivitas, layu pinus, dan kematian dalam waktu satu tahun setelah infeksi1,7,8.
Pengendalian hayati nematoda pinus telah lama menjadi tantangan, dengan tindakan karantina yang telah ada sejak abad ke-20. Strategi pengendalian nematoda pinus saat ini terutama melibatkan perlakuan kimia, termasuk fumigasi kayu dan implantasi nematisida ke dalam batang pohon. Nematisida yang paling umum digunakan adalah avermectin dan avermectin benzoat, yang termasuk dalam famili avermectin. Bahan kimia mahal ini sangat efektif melawan banyak spesies nematoda dan dianggap aman bagi lingkungan9. Namun, penggunaan nematisida ini secara berulang diperkirakan akan menciptakan tekanan seleksi yang hampir pasti akan menyebabkan munculnya nematoda pinus yang resisten, seperti yang telah ditunjukkan pada beberapa hama serangga, seperti Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella, dan nematoda Trichostrongylus colubriformis serta Ostertagia circumcincta, yang secara bertahap telah mengembangkan resistensi terhadap avermectin10,11,12. Oleh karena itu, pola resistensi perlu dipelajari secara berkala dan nematisida perlu disaring secara berkelanjutan untuk menemukan alternatif pengendalian PVD yang hemat biaya dan ramah lingkungan. Dalam beberapa dekade terakhir, sejumlah penulis telah mengusulkan penggunaan ekstrak tumbuhan, minyak atsiri, dan volatil sebagai agen pengendali nematoda13,14,15,16.
Kami baru-baru ini menunjukkan aktivitas nematisida indol, molekul pensinyalan antarsel dan antarkerajaan, pada Caenorhabditis elegans 17 . Indole adalah sinyal intraseluler yang tersebar luas dalam ekologi mikroba, mengendalikan berbagai fungsi yang memengaruhi fisiologi mikroba, pembentukan spora, stabilitas plasmid, resistensi obat, pembentukan biofilm, dan virulensi 18, 19 . Aktivitas indol dan turunannya terhadap nematoda patogen lainnya belum dipelajari. Dalam penelitian ini, kami menyelidiki aktivitas nematisida dari 34 indol terhadap nematoda pinus dan menjelaskan mekanisme kerja 5-iodoindol yang paling kuat menggunakan mikroskopi, fotografi selang waktu, dan eksperimen docking molekuler, dan menilai efek toksiknya pada tanaman menggunakan uji perkecambahan biji.
Konsentrasi tinggi (>1,0 mM) indol sebelumnya telah dilaporkan memiliki efek nematisida pada nematoda17. Setelah perlakuan B. xylophilus (stadium kehidupan campuran) dengan indol atau 33 turunan indol berbeda pada konsentrasi 1 mM, mortalitas B. xylophilus diukur dengan menghitung nematoda hidup dan mati pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan. Lima indol menunjukkan aktivitas nematisida yang signifikan; tingkat kelangsungan hidup kelompok kontrol yang tidak diobati adalah 95 ± 7% setelah 24 jam. Dari 34 indol yang diuji, 5-iodoindol dan 4-fluoroindol pada konsentrasi 1 mM menyebabkan mortalitas 100%, sedangkan 5,6-difluoroindigo, metilindol-7-karboksilat, dan 7-iodoindol menyebabkan mortalitas sekitar 50% (Tabel 1).
Pengaruh 5-iodoindol terhadap pembentukan vakuola dan metabolisme nematoda kayu pinus. (A) Pengaruh avermectin dan 5-iodoindol terhadap nematoda jantan dewasa, (B) Telur nematoda stadium L1 dan (C) Metabolisme B. xylophilus, (i) vakuola tidak teramati pada jam ke-0, perlakuan menghasilkan (ii) vakuola, (iii) akumulasi beberapa vakuola, (iv) pembengkakan vakuola, (v) fusi vakuola, dan (vi) pembentukan vakuola raksasa. Panah merah menunjukkan pembengkakan vakuola, panah biru menunjukkan fusi vakuola, dan panah hitam menunjukkan vakuola raksasa. Skala batang = 50 μm.
Selain itu, penelitian ini juga menggambarkan proses berurutan kematian yang diinduksi metana pada nematoda pinus (Gambar 4C). Kematian metanogenik adalah jenis kematian sel non-apoptotik yang terkait dengan akumulasi vakuola sitoplasma yang menonjol27. Cacat morfologi yang diamati pada nematoda pinus tampaknya terkait erat dengan mekanisme kematian yang diinduksi metana. Pemeriksaan mikroskopis pada waktu yang berbeda menunjukkan bahwa vakuola raksasa terbentuk setelah 20 jam paparan 5-iodoindol (0,1 mM). Vakuola mikroskopis diamati setelah 8 jam perlakuan, dan jumlahnya meningkat setelah 12 jam. Beberapa vakuola besar diamati setelah 14 jam. Beberapa vakuola yang menyatu terlihat jelas setelah 12–16 jam perlakuan, yang menunjukkan bahwa fusi vakuola adalah dasar dari mekanisme kematian metanogenik. Setelah 20 jam, beberapa vakuola raksasa ditemukan di seluruh cacing. Pengamatan ini merupakan laporan pertama metuosis pada C. elegans.
Pada cacing yang diberi perlakuan 5-iodoindol, agregasi dan ruptur vakuola juga diamati (Gambar 5), sebagaimana dibuktikan oleh pembengkokan cacing dan pelepasan vakuola ke lingkungan. Disrupsi vakuola juga diamati pada membran cangkang telur, yang biasanya terawetkan utuh oleh L2 selama penetasan (Gambar Tambahan S2). Pengamatan ini mendukung keterlibatan akumulasi cairan dan kegagalan osmoregulasi, serta cedera sel reversibel (RCI), dalam proses pembentukan dan supurasi vakuola (Gambar 5).
Dengan berhipotesis tentang peran iodin dalam pembentukan vakuola yang diamati, kami menyelidiki aktivitas nematisida natrium iodida (NaI) dan kalium iodida (KI). Namun, pada konsentrasi (0,1, 0,5 atau 1 mM), keduanya tidak memengaruhi kelangsungan hidup nematoda maupun pembentukan vakuola (Gambar Tambahan S5), meskipun KI 1 mM memiliki sedikit efek nematisida. Di sisi lain, 7-iodoindol (1 atau 2 mM), seperti 5-iodoindol, menginduksi beberapa vakuola dan deformasi struktural (Gambar Tambahan S6). Kedua iodoindol menunjukkan karakteristik fenotipik yang serupa pada nematoda pinus, sedangkan NaI dan KI tidak. Menariknya, indol tidak menginduksi pembentukan vakuola pada B. xylophilus pada konsentrasi yang diuji (data tidak ditampilkan). Dengan demikian, hasil tersebut menegaskan bahwa kompleks indol-iodin bertanggung jawab atas vakuolisasi dan metabolisme B. xylophilus.
Di antara indol yang diuji aktivitas nematisidanya, 5-iodoindol memiliki indeks slip tertinggi, yaitu -5,89 kkal/mol, diikuti oleh 7-iodoindol (-4,48 kkal/mol), 4-fluoroindol (-4,33), dan indol (-4,03) (Gambar 6). Ikatan hidrogen yang kuat antara 5-iodoindol dengan leusin 218 menstabilkan ikatannya, sementara semua turunan indol lainnya berikatan dengan serin 260 melalui ikatan hidrogen rantai samping. Di antara iodoindol lain yang dimodelkan, 2-iodoindol memiliki nilai ikatan sebesar -5,248 kkal/mol, yang disebabkan oleh ikatan hidrogen utamanya dengan leusin 218. Ikatan lain yang diketahui meliputi 3-iodoindol (-4,3 kkal/mol), 4-iodoindol (-4,0 kkal/mol), dan 6-fluoroindol (-2,6 kkal/mol) (Gambar Tambahan S8). Sebagian besar indol terhalogenasi dan indol itu sendiri, kecuali 5-iodoindol dan 2-iodoindol, membentuk ikatan dengan serin 260. Fakta bahwa ikatan hidrogen dengan leusin 218 menunjukkan pengikatan reseptor-ligan yang efisien, seperti yang diamati pada ivermectin (Gambar Tambahan S7), menegaskan bahwa 5-iodoindol dan 2-iodoindol, seperti ivermectin, berikatan erat dengan sisi aktif reseptor GluCL melalui leusin 218 (Gambar 6 dan Gambar Tambahan S8). Kami menduga bahwa pengikatan ini diperlukan untuk mempertahankan struktur pori terbuka kompleks GluCL dan dengan mengikat erat sisi aktif reseptor GluCL, 5-iodoindol, 2-iodoindol, avermectin, dan ivermectin menjaga saluran ion tetap terbuka dan memungkinkan penyerapan cairan.
Docking molekul indol dan indol terhalogenasi ke GluCL. Orientasi pengikatan ligan (A) indol, (B) 4-fluoroindol, (C) 7-iodoindol, dan (D) 5-iodoindol ke situs aktif GluCL. Protein diwakili oleh pita, dan ikatan hidrogen tulang punggung ditunjukkan dengan garis putus-putus berwarna kuning. (A′), (B′), (C′), dan (D′) menunjukkan interaksi ligan-ligan yang bersesuaian dengan residu asam amino di sekitarnya, dan ikatan hidrogen rantai samping ditunjukkan dengan panah putus-putus berwarna merah muda.
Percobaan dilakukan untuk mengevaluasi efek toksik 5-iodoindol terhadap perkecambahan biji kubis dan lobak. 5-iodoindol (0,05 atau 0,1 mM) atau avermectin (10 μg/mL) memiliki sedikit atau tidak ada efek pada perkecambahan awal dan kemunculan planlet (Gambar 7). Selain itu, tidak ditemukan perbedaan signifikan antara laju perkecambahan kontrol yang tidak diberi perlakuan dan biji yang diberi perlakuan 5-iodoindol atau avermectin. Efek pada pemanjangan akar tunggang dan jumlah akar lateral yang terbentuk tidak signifikan, meskipun 1 mM (10 kali konsentrasi aktifnya) 5-iodoindol sedikit menunda perkembangan akar lateral. Hasil ini menunjukkan bahwa 5-iodoindol tidak beracun bagi sel tanaman dan tidak mengganggu proses perkembangan tanaman pada konsentrasi yang diteliti.
Pengaruh 5-iodoindol terhadap perkecambahan biji. Perkecambahan, perkecambahan, dan perakaran lateral biji B. oleracea dan R. raphanistrum pada media agar Murashige dan Skoog dengan atau tanpa avermectin atau 5-iodoindol. Perkecambahan dicatat setelah 3 hari inkubasi pada suhu 22°C.
Studi ini melaporkan beberapa kasus indol yang membunuh nematoda. Yang penting, ini merupakan laporan pertama tentang iodoindol yang menginduksi metilasi (proses yang disebabkan oleh akumulasi vakuola kecil yang secara bertahap bergabung menjadi vakuola raksasa, yang akhirnya menyebabkan pecahnya membran dan kematian) pada jarum pinus, dengan iodoindol yang menunjukkan sifat nematisida signifikan yang serupa dengan nematisida komersial avermectin.
Indole sebelumnya telah dilaporkan memiliki beberapa fungsi pensinyalan pada prokariota dan eukariota, termasuk penghambatan/pembentukan biofilm, kelangsungan hidup bakteri, dan patogenisitas19,32,33,34. Baru-baru ini, potensi efek terapeutik indol terhalogenasi, alkaloid indol, dan turunan indol semisintetik telah menarik minat penelitian yang luas35,36,37. Sebagai contoh, indol terhalogenasi telah terbukti membunuh sel Escherichia coli dan Staphylococcus aureus yang persisten37. Selain itu, studi tentang efikasi indol terhalogenasi terhadap spesies, genus, dan kingdom lain merupakan hal yang menarik secara ilmiah, dan studi ini merupakan langkah menuju pencapaian tujuan ini.
Di sini, kami mengusulkan mekanisme kematian akibat 5-iodoindol pada C. elegans berdasarkan cedera sel reversibel (RCI) dan metilasi (Gambar 4C dan 5). Perubahan edema seperti bengkak dan degenerasi vakuola merupakan indikator RCI dan metilasi, yang bermanifestasi sebagai vakuola raksasa di sitoplasma48,49. RCI mengganggu produksi energi dengan mengurangi produksi ATP, menyebabkan kegagalan pompa ATPase, atau mengganggu membran sel dan menyebabkan masuknya Na+, Ca2+, dan air secara cepat50,51,52. Vakuola intrasitoplasma muncul pada sel hewan sebagai akibat dari akumulasi cairan di sitoplasma akibat masuknya Ca2+ dan air53. Menariknya, mekanisme kerusakan sel ini bersifat reversibel jika kerusakannya bersifat sementara dan sel-sel mulai memproduksi ATP selama jangka waktu tertentu, tetapi jika kerusakan berlanjut atau memburuk, sel-sel akan mati.54 Pengamatan kami menunjukkan bahwa nematoda yang diobati dengan 5-iodoindole tidak dapat memulihkan biosintesis normal setelah terpapar kondisi stres.
Fenotipe metilasi yang diinduksi oleh 5-iodoindol pada B. xylophilus mungkin disebabkan oleh keberadaan iodin dan distribusi molekulernya, karena 7-iodoindol memiliki efek penghambatan yang lebih rendah pada B. xylophilus dibandingkan 5-iodoindol (Tabel 1 dan Gambar Tambahan S6). Hasil ini sebagian konsisten dengan penelitian Maltese dkk. (2014), yang melaporkan bahwa translokasi gugus nitrogen piridil dalam indol dari posisi para- ke meta- meniadakan vakuolisasi, penghambatan pertumbuhan, dan sitotoksisitas pada sel U251, yang menunjukkan bahwa interaksi molekul dengan situs aktif spesifik dalam protein tersebut sangat penting27,44,45. Interaksi antara indol atau indol terhalogenasi dan reseptor GluCL yang diamati dalam penelitian ini juga mendukung gagasan ini, karena 5- dan 2-iodoindol ditemukan berikatan dengan reseptor GluCL lebih kuat daripada indol lain yang diperiksa (Gambar 6 dan Gambar Tambahan S8). Iodin pada posisi kedua atau kelima indol diketahui berikatan dengan leusin 218 dari reseptor GluCL melalui ikatan hidrogen tulang punggung, sementara indol terhalogenasi lainnya dan indol itu sendiri membentuk ikatan hidrogen rantai samping yang lemah dengan serin 260 (Gambar 6). Oleh karena itu, kami berspekulasi bahwa lokalisasi halogen berperan penting dalam induksi degenerasi vakuola, sementara ikatan erat 5-iodoindol menjaga saluran ion tetap terbuka, sehingga memungkinkan masuknya cairan dengan cepat dan pecahnya vakuola. Namun, mekanisme kerja 5-iodoindol secara rinci masih harus dijelaskan.
Sebelum aplikasi praktis 5-iodoindol, efek toksiknya terhadap tanaman perlu dianalisis. Percobaan perkecambahan biji kami menunjukkan bahwa 5-iodoindol tidak memiliki efek negatif terhadap perkecambahan biji atau proses perkembangan selanjutnya pada konsentrasi yang diteliti (Gambar 7). Dengan demikian, penelitian ini memberikan dasar bagi penggunaan 5-iodoindol di lingkungan ekologis untuk mengendalikan bahaya nematoda pinus terhadap pohon pinus.
Laporan sebelumnya telah menunjukkan bahwa terapi berbasis indol merupakan pendekatan potensial untuk mengatasi masalah resistensi antibiotik dan perkembangan kanker55. Selain itu, indol memiliki aktivitas antibakteri, antikanker, antioksidan, antiinflamasi, antidiabetik, antivirus, antiproliferatif, dan antituberkulosis, serta dapat menjadi dasar yang menjanjikan untuk pengembangan obat56,57. Studi ini untuk pertama kalinya menunjukkan potensi penggunaan yodium sebagai agen antiparasit dan anthelmintik.
Avermectin ditemukan tiga dekade lalu dan memenangkan Hadiah Nobel pada tahun 2015, dan penggunaannya sebagai anthelmintik masih terus berlanjut. Namun, karena perkembangan resistensi avermectin yang pesat pada nematoda dan hama serangga, diperlukan strategi alternatif yang murah dan ramah lingkungan untuk mengendalikan infeksi PWN pada pohon pinus. Studi ini juga melaporkan mekanisme 5-iodoindol dalam membunuh nematoda pinus dan bahwa 5-iodoindol memiliki toksisitas rendah terhadap sel tanaman, yang membuka prospek cerah untuk aplikasi komersialnya di masa mendatang.
Semua percobaan disetujui oleh Komite Etik Universitas Yeungnam, Gyeongsan, Korea, dan metode dilakukan sesuai dengan pedoman Komite Etik Universitas Yeungnam.
Percobaan inkubasi telur dilakukan menggunakan prosedur yang telah ditetapkan43. Untuk menilai tingkat penetasan (HR), nematoda dewasa berumur 1 hari (sekitar 100 betina dan 100 jantan) dipindahkan ke cawan Petri yang berisi jamur dan dibiarkan tumbuh selama 24 jam. Telur kemudian diisolasi dan diberi perlakuan suspensi 5-iodoindol (0,05 mM dan 0,1 mM) atau avermectin (10 μg/ml) dalam air suling steril. Suspensi ini (500 μl; sekitar 100 telur) dipindahkan ke dalam sumur-sumur pada pelat kultur jaringan 24 sumur dan diinkubasi pada suhu 22 °C. Penghitungan L2 dilakukan setelah 24 jam inkubasi, tetapi dianggap mati jika sel-sel tidak bergerak ketika distimulasi dengan kawat platina halus. Percobaan ini dilakukan dalam dua tahap, masing-masing dengan enam kali pengulangan. Data dari kedua percobaan digabungkan dan disajikan. Persentase HR dihitung sebagai berikut:
Mortalitas larva dinilai menggunakan prosedur yang telah dikembangkan sebelumnya. Telur nematoda dikumpulkan dan embrio disinkronkan dengan menetaskannya dalam air suling steril untuk menghasilkan larva stadium L2. Larva yang tersinkronisasi (sekitar 500 nematoda) diberi perlakuan 5-iodoindol (0,05 mM dan 0,1 mM) atau avermectin (10 μg/ml) dan dipelihara pada cawan Petri B. cinerea. Setelah 48 jam inkubasi pada suhu 22 °C, nematoda dikumpulkan dalam air suling steril dan diperiksa keberadaan stadium L2, L3, dan L4. Keberadaan stadium L3 dan L4 menunjukkan transformasi larva, sedangkan keberadaan stadium L2 menunjukkan tidak adanya transformasi. Citra diperoleh menggunakan Sistem Pencitraan Sel Digital iRiS™. Percobaan ini dilakukan dalam dua tahap, masing-masing dengan enam pengulangan. Data dari kedua percobaan digabungkan dan disajikan.
Toksisitas 5-iodoindole dan avermectin terhadap benih dinilai menggunakan uji perkecambahan pada pelat agar Murashige dan Skoog.62 Benih B. oleracea dan R. raphanistrum pertama-tama direndam dalam air suling steril selama satu hari, dicuci dengan 1 ml etanol 100%, disterilkan dengan 1 ml pemutih komersial 50% (natrium hipoklorit 3%) selama 15 menit, dan dicuci lima kali dengan 1 ml air steril. Benih yang telah disterilkan kemudian ditekan ke pelat agar perkecambahan yang berisi media Murashige dan Skoog 0,86 g/l (0,2X) dan agar bakteriologis 0,7% dengan atau tanpa 5-iodoindole atau avermectin. Pelat kemudian diinkubasi pada suhu 22 °C, dan gambar diambil setelah 3 hari inkubasi. Percobaan ini dilakukan dalam dua tahap, yang masing-masing memiliki enam pengulangan.
Waktu posting: 26-Feb-2025