Nematoda pinus adalah endoparasit migrasi karantina yang dikenal menyebabkan kerugian ekonomi yang parah di ekosistem hutan pinus. Studi ini meninjau aktivitas nematisida indol terhalogenasi terhadap nematoda pinus dan mekanisme kerjanya. Aktivitas nematisida 5-iodoindol dan avermektin (kontrol positif) terhadap nematoda pinus serupa dan tinggi pada konsentrasi rendah (10 μg/mL). 5-iodoindol mengurangi fekunditas, aktivitas reproduksi, mortalitas embrio dan larva, serta perilaku lokomotor. Interaksi molekuler ligan dengan reseptor saluran klorida yang diatur glutamat spesifik invertebrata mendukung gagasan bahwa 5-iodoindol, seperti avermektin, mengikat erat pada situs aktif reseptor. 5-Iodoindol juga menginduksi berbagai deformasi fenotipik pada nematoda, termasuk kolaps/penyusutan organ abnormal dan peningkatan vakuolisasi. Hasil ini menunjukkan bahwa vakuola mungkin berperan dalam kematian nematoda yang dimediasi oleh metilasi. Yang penting, 5-iodoindole tidak beracun bagi kedua spesies tanaman (kubis dan lobak). Dengan demikian, penelitian ini menunjukkan bahwa aplikasi iodoindole dalam kondisi lingkungan dapat mengendalikan kerusakan akibat penyakit layu pinus.
Nematoda kayu pinus (Bursaphelenchus xylophilus) termasuk dalam kelompok nematoda kayu pinus (PWN), yaitu nematoda endoparasit migrasi yang dikenal menyebabkan kerusakan ekologis parah pada ekosistem hutan pinus1. Penyakit layu pinus (PWD) yang disebabkan oleh nematoda kayu pinus menjadi masalah serius di beberapa benua, termasuk Asia dan Eropa, dan di Amerika Utara, nematoda ini menghancurkan spesies pinus introduksi1,2. Penurunan populasi pohon pinus merupakan masalah ekonomi utama, dan prospek penyebarannya secara global sangat mengkhawatirkan3. Spesies pinus berikut ini paling sering diserang oleh nematoda: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii, dan Pinus radiata4. Nematoda pinus adalah penyakit serius yang dapat membunuh pohon pinus dalam beberapa minggu atau bulan setelah infeksi. Selain itu, wabah nematoda pinus sering terjadi di berbagai ekosistem, sehingga rantai infeksi yang persisten telah terbentuk1.
Bursaphelenchus xylophilus adalah nematoda parasit tanaman karantina yang termasuk dalam superfamili Aphelenchoidea dan klad 102.5. Nematoda ini memakan jamur dan bereproduksi di jaringan kayu pohon pinus, berkembang menjadi empat tahap larva yang berbeda: L1, L2, L3, L4 dan individu dewasa1,6. Dalam kondisi kekurangan makanan, nematoda pinus ini memasuki tahap larva khusus – dauer, yang memparasit vektornya – kumbang kulit pinus (Monochamus alternatus) dan ditularkan ke pohon pinus yang sehat. Pada inang yang sehat, nematoda dengan cepat bermigrasi melalui jaringan tanaman dan memakan sel parenkim, yang menyebabkan sejumlah reaksi hipersensitivitas, layu pinus, dan kematian dalam waktu satu tahun setelah infeksi1,7,8.
Pengendalian hayati nematoda pinus telah lama menjadi tantangan, dengan tindakan karantina yang dimulai sejak abad ke-20. Strategi saat ini untuk mengendalikan nematoda pinus terutama melibatkan perlakuan kimia, termasuk fumigasi kayu dan implantasi nematisida ke dalam batang pohon. Nematisida yang paling umum digunakan adalah avermectin dan avermectin benzoat, yang termasuk dalam famili avermectin. Bahan kimia mahal ini sangat efektif terhadap banyak spesies nematoda dan dianggap aman bagi lingkungan9. Namun, penggunaan berulang nematisida ini diperkirakan akan menciptakan tekanan seleksi yang hampir pasti akan menyebabkan munculnya nematoda pinus yang resisten, seperti yang telah ditunjukkan pada beberapa hama serangga, seperti Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella dan nematoda Trichostrongylus colubriformis dan Ostertagia circumcincta, yang secara bertahap mengembangkan resistensi terhadap avermectin10,11,12. Oleh karena itu, pola resistensi perlu dipelajari secara teratur dan nematisida perlu terus diuji untuk menemukan alternatif, hemat biaya, dan ramah lingkungan dalam mengendalikan PVD. Dalam beberapa dekade terakhir, sejumlah penulis telah mengusulkan penggunaan ekstrak tumbuhan, minyak atsiri, dan senyawa volatil sebagai agen pengendali nematoda13,14,15,16.
Baru-baru ini kami mendemonstrasikan aktivitas nematisida indol, molekul pensinyalan antar sel dan antar kerajaan, pada Caenorhabditis elegans 17. Indol adalah sinyal intraseluler yang tersebar luas dalam ekologi mikroba, mengendalikan berbagai fungsi yang memengaruhi fisiologi mikroba, pembentukan spora, stabilitas plasmid, resistensi obat, pembentukan biofilm, dan virulensi 18, 19. Aktivitas indol dan turunannya terhadap nematoda patogen lainnya belum dipelajari. Dalam penelitian ini, kami menyelidiki aktivitas nematisida dari 34 indol terhadap nematoda pinus dan menjelaskan mekanisme kerja 5-iodoindol yang paling ampuh menggunakan mikroskop, fotografi time-lapse, dan eksperimen penambatan molekuler, serta menilai efek toksiknya pada tanaman menggunakan uji perkecambahan biji.
Konsentrasi indol yang tinggi (>1,0 mM) sebelumnya telah dilaporkan memiliki efek nematisida pada nematoda17. Setelah perlakuan B. xylophilus (tahap kehidupan campuran) dengan indol atau 33 turunan indol yang berbeda pada konsentrasi 1 mM, mortalitas B. xylophilus diukur dengan menghitung nematoda hidup dan mati pada kelompok kontrol dan kelompok yang diberi perlakuan. Lima indol menunjukkan aktivitas nematisida yang signifikan; tingkat kelangsungan hidup kelompok kontrol yang tidak diberi perlakuan adalah 95 ± 7% setelah 24 jam. Dari 34 indol yang diuji, 5-iodoindol dan 4-fluoroindol pada konsentrasi 1 mM menyebabkan mortalitas 100%, sedangkan 5,6-difluoroindigo, metilindol-7-karboksilat, dan 7-iodoindol menyebabkan mortalitas sekitar 50% (Tabel 1).
Pengaruh 5-iodoindole terhadap pembentukan vakuola dan metabolisme nematoda kayu pinus. (A) Pengaruh avermectin dan 5-iodoindole pada nematoda jantan dewasa, (B) telur nematoda stadium L1 dan (C) metabolisme B. xylophilus, (i) vakuola tidak diamati pada 0 jam, perlakuan menghasilkan (ii) vakuola, (iii) akumulasi beberapa vakuola, (iv) pembengkakan vakuola, (v) fusi vakuola dan (vi) pembentukan vakuola raksasa. Panah merah menunjukkan pembengkakan vakuola, panah biru menunjukkan fusi vakuola dan panah hitam menunjukkan vakuola raksasa. Skala bar = 50 μm.
Selain itu, penelitian ini juga menjelaskan proses berurutan kematian yang diinduksi metana pada nematoda pinus (Gambar 4C). Kematian metanogenik adalah jenis kematian sel non-apoptosis yang terkait dengan akumulasi vakuola sitoplasma yang menonjol27. Cacat morfologis yang diamati pada nematoda pinus tampaknya terkait erat dengan mekanisme kematian yang diinduksi metana. Pemeriksaan mikroskopis pada waktu yang berbeda menunjukkan bahwa vakuola raksasa terbentuk setelah 20 jam terpapar 5-iodoindole (0,1 mM). Vakuola mikroskopis diamati setelah 8 jam pengobatan, dan jumlahnya meningkat setelah 12 jam. Beberapa vakuola besar diamati setelah 14 jam. Beberapa vakuola yang menyatu terlihat jelas setelah 12–16 jam pengobatan, menunjukkan bahwa fusi vakuola adalah dasar dari mekanisme kematian metanogenik. Setelah 20 jam, beberapa vakuola raksasa ditemukan di seluruh cacing. Pengamatan ini merupakan laporan pertama tentang metanosis pada C. elegans.
Pada cacing yang diberi perlakuan 5-iodoindole, agregasi dan pecahnya vakuola juga diamati (Gambar 5), yang dibuktikan dengan pembengkokan cacing dan pelepasan vakuola ke lingkungan. Gangguan vakuola juga diamati pada membran cangkang telur, yang biasanya dijaga tetap utuh oleh L2 selama penetasan (Gambar Tambahan S2). Pengamatan ini mendukung keterlibatan akumulasi cairan dan kegagalan osmoregulasi, serta cedera sel reversibel (RCI), dalam proses pembentukan dan supurasi vakuola (Gambar 5).
Dengan berhipotesis mengenai peran yodium dalam pembentukan vakuola yang diamati, kami menyelidiki aktivitas nematisida natrium iodida (NaI) dan kalium iodida (KI). Namun, pada konsentrasi (0,1, 0,5 atau 1 mM), keduanya tidak memengaruhi kelangsungan hidup nematoda maupun pembentukan vakuola (Gambar Tambahan S5), meskipun KI 1 mM memiliki sedikit efek nematisida. Di sisi lain, 7-iodoindol (1 atau 2 mM), seperti 5-iodoindol, menginduksi banyak vakuola dan deformasi struktural (Gambar Tambahan S6). Kedua iodoindol menunjukkan karakteristik fenotipik yang serupa pada nematoda pinus, sedangkan NaI dan KI tidak. Menariknya, indol tidak menginduksi pembentukan vakuola pada B. xylophilus pada konsentrasi yang diuji (data tidak ditunjukkan). Dengan demikian, hasil tersebut mengkonfirmasi bahwa kompleks indol-yodium bertanggung jawab atas vakuolisasi dan metabolisme B. xylophilus.
Di antara indol yang diuji untuk aktivitas nematisida, 5-iodoindol memiliki indeks slip tertinggi sebesar -5,89 kkal/mol, diikuti oleh 7-iodoindol (-4,48 kkal/mol), 4-fluoroindol (-4,33), dan indol (-4,03) (Gambar 6). Ikatan hidrogen tulang punggung yang kuat dari 5-iodoindol ke leusin 218 menstabilkan ikatannya, sedangkan semua turunan indol lainnya berikatan dengan serin 260 melalui ikatan hidrogen rantai samping. Di antara iodoindol lain yang dimodelkan, 2-iodoindol memiliki nilai pengikatan -5,248 kkal/mol, yang disebabkan oleh ikatan hidrogen utamanya dengan leusin 218. Pengikatan lain yang diketahui termasuk 3-iodoindol (-4,3 kkal/mol), 4-iodoindol (-4,0 kkal/mol), dan 6-fluoroindol (-2,6 kkal/mol) (Gambar Tambahan S8). Sebagian besar indol terhalogenasi dan indol itu sendiri, kecuali 5-iodoindol dan 2-iodoindol, membentuk ikatan dengan serin 260. Fakta bahwa ikatan hidrogen dengan leusin 218 menunjukkan pengikatan reseptor-ligan yang efisien, seperti yang diamati pada ivermectin (Gambar Tambahan S7), menegaskan bahwa 5-iodoindol dan 2-iodoindol, seperti ivermectin, mengikat erat ke situs aktif reseptor GluCL melalui leusin 218 (Gambar 6 dan Gambar Tambahan S8). Kami mengusulkan bahwa pengikatan ini diperlukan untuk mempertahankan struktur pori terbuka kompleks GluCL dan bahwa dengan mengikat erat ke situs aktif reseptor GluCL, 5-iodoindol, 2-iodoindol, avermectin, dan ivermectin dengan demikian mempertahankan saluran ion tetap terbuka dan memungkinkan penyerapan cairan.
Penambatan molekuler indol dan indol terhalogenasi ke GluCL. Orientasi pengikatan ligan (A) indol, (B) 4-fluoroindol, (C) 7-iodoindol, dan (D) 5-iodoindol ke situs aktif GluCL. Protein direpresentasikan oleh pita, dan ikatan hidrogen tulang punggung ditunjukkan sebagai garis putus-putus kuning. (A′), (B′), (C′), dan (D′) menunjukkan interaksi ligan yang sesuai dengan residu asam amino di sekitarnya, dan ikatan hidrogen rantai samping ditunjukkan oleh panah putus-putus merah muda.
Percobaan dilakukan untuk mengevaluasi efek toksik 5-iodoindole terhadap perkecambahan biji kubis dan lobak. 5-iodoindole (0,05 atau 0,1 mM) atau avermectin (10 μg/mL) memiliki sedikit atau tidak ada efek pada perkecambahan awal dan kemunculan bibit (Gambar 7). Selain itu, tidak ditemukan perbedaan signifikan antara tingkat perkecambahan kontrol yang tidak diberi perlakuan dan biji yang diberi perlakuan 5-iodoindole atau avermectin. Efek pada pemanjangan akar utama dan jumlah akar lateral yang terbentuk tidak signifikan, meskipun 1 mM (10 kali konsentrasi aktifnya) 5-iodoindole sedikit menunda perkembangan akar lateral. Hasil ini menunjukkan bahwa 5-iodoindole tidak beracun bagi sel tanaman dan tidak mengganggu proses perkembangan tanaman pada konsentrasi yang diteliti.
Pengaruh 5-iodoindole terhadap perkecambahan biji. Perkecambahan, tunas, dan perakaran lateral biji B. oleracea dan R. raphanistrum pada media agar Murashige dan Skoog dengan atau tanpa avermectin atau 5-iodoindole. Perkecambahan dicatat setelah 3 hari inkubasi pada suhu 22°C.
Studi ini melaporkan beberapa kasus pembunuhan nematoda oleh indol. Yang penting, ini adalah laporan pertama tentang iodoindol yang menginduksi metilasi (suatu proses yang disebabkan oleh akumulasi vakuola kecil yang secara bertahap bergabung menjadi vakuola raksasa, yang akhirnya menyebabkan pecahnya membran dan kematian) pada jarum pinus, dengan iodoindol menunjukkan sifat nematisida yang signifikan serupa dengan nematisida komersial avermectin.
Indol sebelumnya telah dilaporkan memiliki berbagai fungsi pensinyalan pada prokariota dan eukariota, termasuk penghambatan/pembentukan biofilm, kelangsungan hidup bakteri, dan patogenisitas19,32,33,34. Baru-baru ini, potensi efek terapeutik indol terhalogenasi, alkaloid indol, dan turunan indol semisintetik telah menarik minat penelitian yang luas35,36,37. Misalnya, indol terhalogenasi telah terbukti membunuh sel Escherichia coli dan Staphylococcus aureus yang persisten37. Selain itu, mempelajari kemanjuran indol terhalogenasi terhadap spesies, genus, dan kerajaan lain juga menarik secara ilmiah, dan penelitian ini merupakan langkah menuju pencapaian tujuan tersebut.
Di sini, kami mengusulkan mekanisme kematian yang diinduksi oleh 5-iodoindole pada C. elegans berdasarkan cedera sel reversibel (RCI) dan metilasi (Gambar 4C dan 5). Perubahan edema seperti pembengkakan dan degenerasi vakuola merupakan indikator RCI dan metilasi, yang dimanifestasikan sebagai vakuola raksasa di sitoplasma48,49. RCI mengganggu produksi energi dengan mengurangi produksi ATP, menyebabkan kegagalan pompa ATPase, atau mengganggu membran sel dan menyebabkan masuknya Na+, Ca2+, dan air secara cepat50,51,52. Vakuola intrasitoplasma muncul pada sel hewan sebagai akibat dari akumulasi cairan di sitoplasma karena masuknya Ca2+ dan air53. Menariknya, mekanisme kerusakan sel ini bersifat reversibel jika kerusakannya bersifat sementara dan sel mulai memproduksi ATP untuk jangka waktu tertentu, tetapi jika kerusakannya berlanjut atau memburuk, sel akan mati.54 Pengamatan kami menunjukkan bahwa nematoda yang diberi perlakuan 5-iodoindole tidak mampu memulihkan biosintesis normal setelah terpapar kondisi stres.
Fenotipe metilasi yang diinduksi oleh 5-iodoindole pada B. xylophilus mungkin disebabkan oleh keberadaan yodium dan distribusi molekulnya, karena 7-iodoindole memiliki efek penghambatan yang lebih rendah pada B. xylophilus daripada 5-iodoindole (Tabel 1 dan Gambar Tambahan S6). Hasil ini sebagian konsisten dengan penelitian Maltese dkk. (2014), yang melaporkan bahwa translokasi gugus nitrogen piridil dalam indol dari posisi para ke posisi meta menghilangkan vakuolisasi, penghambatan pertumbuhan, dan sitotoksisitas pada sel U251, menunjukkan bahwa interaksi molekul dengan situs aktif spesifik dalam protein sangat penting27,44,45. Interaksi antara indol atau indol terhalogenasi dan reseptor GluCL yang diamati dalam penelitian ini juga mendukung gagasan ini, karena 5- dan 2-iodoindole ditemukan berikatan dengan reseptor GluCL lebih kuat daripada indol lain yang diperiksa (Gambar 6 dan Gambar Tambahan S8). Iodin pada posisi kedua atau kelima indol ditemukan berikatan dengan leusin 218 dari reseptor GluCL melalui ikatan hidrogen tulang punggung, sedangkan indol terhalogenasi lainnya dan indol itu sendiri membentuk ikatan hidrogen rantai samping yang lemah dengan serin 260 (Gambar 6). Oleh karena itu, kami berspekulasi bahwa lokalisasi halogen memainkan peran penting dalam induksi degenerasi vakuolar, sedangkan ikatan kuat 5-iodoindol menjaga saluran ion tetap terbuka, sehingga memungkinkan masuknya cairan dengan cepat dan pecahnya vakuola. Namun, mekanisme kerja 5-iodoindol secara rinci masih perlu ditentukan.
Sebelum penerapan praktis 5-iodoindole, efek toksiknya pada tanaman harus dianalisis. Percobaan perkecambahan biji kami menunjukkan bahwa 5-iodoindole tidak memiliki efek negatif pada perkecambahan biji atau proses perkembangan selanjutnya pada konsentrasi yang diteliti (Gambar 7). Dengan demikian, penelitian ini memberikan dasar untuk penggunaan 5-iodoindole di lingkungan ekologi untuk mengendalikan bahaya nematoda pinus terhadap pohon pinus.
Laporan sebelumnya telah menunjukkan bahwa terapi berbasis indol merupakan pendekatan potensial untuk mengatasi masalah resistensi antibiotik dan perkembangan kanker55. Selain itu, indol memiliki aktivitas antibakteri, antikanker, antioksidan, antiinflamasi, antidiabetes, antivirus, antiproliferatif, dan antituberkulosis dan dapat menjadi dasar yang menjanjikan untuk pengembangan obat56,57. Studi ini menunjukkan untuk pertama kalinya potensi penggunaan yodium sebagai agen antiparasit dan antelmintik.
Avermectin ditemukan tiga dekade lalu dan memenangkan Hadiah Nobel pada tahun 2015, dan penggunaannya sebagai obat cacing masih aktif hingga saat ini. Namun, karena perkembangan resistensi yang cepat terhadap avermectin pada nematoda dan hama serangga, strategi alternatif yang hemat biaya dan ramah lingkungan diperlukan untuk mengendalikan infeksi PWN pada pohon pinus. Studi ini juga melaporkan mekanisme bagaimana 5-iodoindole membunuh nematoda pinus dan bahwa 5-iodoindole memiliki toksisitas rendah terhadap sel tanaman, yang membuka prospek yang baik untuk aplikasi komersialnya di masa depan.
Semua percobaan telah disetujui oleh Komite Etika Universitas Yeungnam, Gyeongsan, Korea, dan metode yang digunakan dilakukan sesuai dengan pedoman Komite Etika Universitas Yeungnam.
Percobaan inkubasi telur dilakukan menggunakan prosedur yang telah ditetapkan43. Untuk menilai tingkat penetasan (HR), nematoda dewasa berumur 1 hari (sekitar 100 betina dan 100 jantan) dipindahkan ke cawan Petri yang berisi jamur dan dibiarkan tumbuh selama 24 jam. Telur kemudian diisolasi dan diberi perlakuan dengan 5-iodoindole (0,05 mM dan 0,1 mM) atau avermectin (10 μg/ml) sebagai suspensi dalam air suling steril. Suspensi ini (500 μl; sekitar 100 telur) dipindahkan ke sumur pelat kultur jaringan 24 sumur dan diinkubasi pada suhu 22 °C. Penghitungan L2 dilakukan setelah 24 jam inkubasi tetapi dianggap mati jika sel tidak bergerak ketika dirangsang dengan kawat platinum halus. Percobaan ini dilakukan dalam dua tahap, masing-masing dengan enam pengulangan. Data dari kedua percobaan digabungkan dan disajikan. Persentase HR dihitung sebagai berikut:
Mortalitas larva dinilai menggunakan prosedur yang telah dikembangkan sebelumnya. Telur nematoda dikumpulkan dan embrio disinkronkan dengan penetasan dalam air suling steril untuk menghasilkan larva stadium L2. Larva yang disinkronkan (sekitar 500 nematoda) diberi perlakuan dengan 5-iodoindole (0,05 mM dan 0,1 mM) atau avermectin (10 μg/ml) dan dibiakkan pada cawan Petri B. cinerea. Setelah inkubasi selama 48 jam pada suhu 22 °C, nematoda dikumpulkan dalam air suling steril dan diperiksa keberadaan stadium L2, L3, dan L4. Keberadaan stadium L3 dan L4 menunjukkan transformasi larva, sedangkan keberadaan stadium L2 menunjukkan tidak adanya transformasi. Gambar diperoleh menggunakan Sistem Pencitraan Sel Digital iRiS™. Percobaan ini dilakukan dalam dua tahap, masing-masing dengan enam pengulangan. Data dari kedua percobaan digabungkan dan disajikan.
Toksisitas 5-iodoindole dan avermectin terhadap biji dinilai menggunakan uji perkecambahan pada cawan agar Murashige dan Skoog.62 Biji B. oleracea dan R. raphanistrum pertama-tama direndam dalam air suling steril selama satu hari, dicuci dengan 1 ml etanol 100%, disterilkan dengan 1 ml pemutih komersial 50% (3% natrium hipoklorit) selama 15 menit, dan dicuci lima kali dengan 1 ml air steril. Biji yang telah disterilkan kemudian ditekan ke cawan agar perkecambahan yang mengandung 0,86 g/l (0,2X) media Murashige dan Skoog dan 0,7% agar bakteriologis dengan atau tanpa 5-iodoindole atau avermectin. Cawan kemudian diinkubasi pada suhu 22 °C, dan gambar diambil setelah 3 hari inkubasi. Percobaan ini dilakukan dalam dua tahap, masing-masing dengan enam pengulangan.
Waktu posting: 26 Februari 2025