Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk hasil terbaik, kami sarankan Anda menggunakan versi browser yang lebih baru (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami menampilkan situs tanpa gaya atau JavaScript.
Penemuan dan penggunaan produk alami yang bermanfaat dapat membantu meningkatkan kehidupan manusia. Bahan kimia penghambat pertumbuhan tanaman banyak digunakan sebagai herbisida untuk mengendalikan gulma. Karena kebutuhan untuk menggunakan berbagai jenis herbisida, ada kebutuhan untuk mengidentifikasi senyawa dengan mekanisme kerja baru. Dalam penelitian ini, kami menemukan senyawa N-alkoxypyrrole baru, coumamonamide, dari Streptomyces werraensis MK493-CF1 dan menetapkan proses sintesis yang lengkap. Melalui uji aktivitas biologis, kami menemukan bahwa asam urs-monoamic adalah perantara sintetis dari urs-monoamide dan berpotensipenghambat pertumbuhan tanaman. Selain itu, kami telah mengembangkan berbagai turunan asam urbenonat, termasuk turunan urbenyloxy (UDA), yang memiliki aktivitas herbisida tinggi tanpa berdampak negatif pada pertumbuhan sel HeLa. Kami juga menemukan bahwa turunan asam urmotonik mengganggu mikrotubulus tanaman; selain itu, KAND memengaruhi filamen aktin dan menginduksi kematian sel; Efek multifaset ini berbeda dari efek penghambat mikrotubulus yang diketahui dan menunjukkan mekanisme kerja baru untuk asam ursonik, yang merupakan keuntungan penting dalam pengembangan herbisida baru.
Penemuan dan penerapan praktis produk alami yang bermanfaat dan turunannya merupakan sarana untuk meningkatkan kualitas hidup manusia. Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikroorganisme, tanaman, dan serangga telah menghasilkan kemajuan besar dalam bidang kedokteran dan pertanian. Banyak antibiotik dan obat anti-leukemia telah dikembangkan dari bahan alami. Selain itu, berbagai jenispestisida, fungisida dan herbisida diekstrak dari produk alami ini untuk digunakan dalam pertanian. Secara khusus, herbisida pengendali gulma merupakan alat penting untuk meningkatkan hasil panen dalam pertanian modern, dan berbagai jenis senyawa sudah digunakan secara komersial. Beberapa proses seluler pada tanaman, seperti fotosintesis, metabolisme asam amino, sintesis dinding sel, regulasi mitosis, pensinyalan fitohormon, atau sintesis protein, dianggap sebagai target khas herbisida. Senyawa yang menghambat fungsi mikrotubulus merupakan golongan herbisida umum yang memengaruhi pertumbuhan tanaman dengan memengaruhi regulasi mitosis2.
Mikrotubulus merupakan komponen dari sitoskeleton dan secara luas terkonservasi dalam sel eukariotik. Heterodimer tubulin terdiri dari α-tubulin dan β-tubulin yang membentuk protofilamen mikrotubulus linier, dengan 13 protofilamen yang membentuk struktur silinder. Mikrotubulus memainkan banyak peran dalam sel tumbuhan, termasuk menentukan bentuk sel, pembelahan sel, dan transportasi intraseluler3,4. Sel tumbuhan mengandung mikrotubulus di bawah membran plasma interfase, dan yang disebut mikrotubulus kortikal ini diperkirakan mengendalikan pengaturan mikrofibril selulosa melalui regulasi kompleks sintase selulosa4,5. Mikrotubulus kortikal sel epidermis akar, yang terdapat di zona pemanjangan cepat ujung akar, terletak di bagian lateral, dan serat mikro selulosa mengikuti mikrotubulus ini dan membatasi arah ekspansi sel, sehingga mendorong pemanjangan sel anisotropik. Oleh karena itu, fungsi mikrotubulus berkaitan erat dengan morfologi tumbuhan. Substitusi asam amino pada gen yang mengkode tubulin menyebabkan kemiringan susunan mikrotubulus kortikal dan pertumbuhan sisi kiri atau kanan pada Arabidopsis 6,7. Demikian pula, mutasi pada protein terkait mikrotubulus yang mengatur dinamika mikrotubulus juga dapat menyebabkan pertumbuhan akar yang terdistorsi8,9,10,11,12,13. Selain itu, pengobatan dengan herbisida pengganggu mikrotubulus seperti disopiramid, yang juga dikenal sebagai pretilaklor, juga menyebabkan pertumbuhan akar miring sisi kiri14. Data ini menunjukkan bahwa pengaturan fungsi mikrotubulus yang tepat sangat penting untuk menentukan arah pertumbuhan tanaman.
Berbagai jenis penghambat mikrotubulus telah ditemukan, dan obat-obatan ini telah memberikan kontribusi yang signifikan terhadap penelitian sitoskeletal, serta pertanian dan kedokteran2. Secara khusus, oryzalin, senyawa dinitroanilin, disopiramid, senyawa terkait benzamida, dan analognya dapat menghambat fungsi mikrotubulus dan dengan demikian menghambat pertumbuhan tanaman. Oleh karena itu, mereka banyak digunakan sebagai herbisida. Namun, karena mikrotubulus merupakan komponen penting dari sel tumbuhan dan hewan, sebagian besar penghambat mikrotubulus bersifat sitotoksik terhadap kedua jenis sel tersebut. Oleh karena itu, meskipun kegunaannya dikenal sebagai herbisida, sejumlah kecil agen antimikrotubulus digunakan untuk tujuan praktis.
Streptomyces adalah genus dari famili Streptomyces, yang mencakup bakteri aerobik, gram positif, berfilamen dan dikenal luas karena kemampuannya menghasilkan berbagai macam metabolit sekunder. Oleh karena itu, ia dianggap sebagai salah satu sumber terpenting produk alami baru yang aktif secara biologis. Dalam penelitian saat ini, kami menemukan senyawa baru yang disebut kumamonamida, yang diisolasi dari Streptomyces werraensis MK493-CF1 dan S. werraensis ISP 5486. Menggunakan analisis spektral dan analisis spektral penuh, struktur kumamonamida dikarakterisasi dan kerangka N-alkoksipirolnya yang unik ditentukan. sintesis. Asam ursmonat, zat antara sintetis ursmonoamida dan turunannya, ditemukan dapat menghambat pertumbuhan dan perkecambahan tanaman model populer Arabidopsis thaliana. Dalam studi hubungan struktur-aktivitas, kami menemukan bahwa senyawa dengan C9 yang dimodifikasi menjadi asam ursonik, yang disebut turunan noniloksi asam ursonik (KAND), secara signifikan meningkatkan efek penghambatan pada pertumbuhan dan perkecambahan. Khususnya, penghambat pertumbuhan tanaman yang baru ditemukan juga memengaruhi pertumbuhan tembakau dan lumut hati dan tidak sitotoksik terhadap bakteri atau sel HeLa. Selain itu, beberapa turunan asam urmotonik menginduksi fenotipe akar yang terdistorsi, yang menyiratkan bahwa turunan ini secara langsung atau tidak langsung memengaruhi mikrotubulus. Konsisten dengan gagasan ini, pengamatan kami terhadap mikrotubulus yang diberi label baik secara imunohistokimia atau dengan protein fluoresen menunjukkan bahwa perlakuan KAND mendepolimerisasi mikrotubulus. Selain itu, perlakuan dengan turunan asam kumamotonik mengganggu mikrofilamen aktin. Dengan demikian, kami telah menemukan penghambat pertumbuhan tanaman baru yang mekanisme kerjanya yang unik melibatkan penghancuran sitoskeleton.
Galur MK493-CF1 diisolasi dari tanah di Shinagawa-ku, Tokyo. Galur MK493-CF1 membentuk miselium stroma bercabang baik. Urutan parsial gen RNA ribosomal 16S (1422 bp) ditentukan. Galur ini sangat mirip dengan S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: galur khas, 99,93%). Berdasarkan hasil ini, ditentukan bahwa galur ini terkait erat dengan galur tipe S. werraensis. Oleh karena itu, kami untuk sementara menamai galur ini S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T juga menghasilkan senyawa bioaktif yang sama. Karena hanya ada sedikit penelitian awal untuk mendapatkan produk alami dari mikroorganisme ini, penelitian kimia lebih lanjut dilakukan. Setelah budidaya S. werraensis MK493-CF1 pada media barley dengan fermentasi solid-state pada suhu 30°C selama 14 hari, media tersebut diekstraksi dengan 50% EtOH. Sebanyak 60 ml sampel dikeringkan untuk memperoleh 59,5 mg ekstrak kasar. Ekstrak kasar tersebut dikenai HPLC fase terbalik untuk menghasilkan N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamida (1, bernama kumamonamida, 36,0 mg). Jumlah total 1 adalah sekitar 60% dari ekstrak kasar. Oleh karena itu, kami memutuskan untuk mempelajari secara rinci sifat-sifat kumamotoamida 1.
Kumamonamida 1 adalah bubuk amorf putih dan spektrometri massa resolusi tinggi (HRESIMS) mengonfirmasi C6H8N2O2 (Gbr. 1). Fragmen pirol tersubstitusi C2 dari senyawa ini dicirikan oleh δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH dalam spektrum NMR 1H: 4,5 Hz, H-5) dan δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), dan spektrum NMR 13C menunjukkan keberadaan empat atom karbon sp2. Keberadaan gugus amida pada posisi C2 dinilai dengan korelasi HMBC dari proton C-3 ke karbon karbonil amida pada δC 161,1. Selain itu, puncak NMR 1H dan 13C pada δH 4,10 (3H, S) dan δC 68,3 menunjukkan keberadaan gugus N-metoksi dalam molekul tersebut. Meskipun posisi gugus metoksi yang benar belum ditentukan menggunakan analisis spektroskopi seperti spektroskopi perbedaan yang disempurnakan dan singkatan Overhauser nuklir (NOEDF), N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamida menjadi senyawa kandidat pertama.
Untuk menentukan struktur yang benar dari 1, sintesis total dilakukan (Gbr. 2a). Perlakuan 2-aminopiridina 2 yang tersedia secara komersial dengan m-CPBA menghasilkan N-oksida 3 yang sesuai dalam hasil kuantitatif. Setelah 2-aminoazidasi 2, reaksi siklokondensasi yang dijelaskan oleh Abramovich dilakukan dalam benzena pada suhu 90°C untuk memperoleh 1-hidroksi-1H-pirol-2-karbonitril 5 yang diinginkan dalam gram. Kecepatan 60% (dua tahap). 15,16. Metilasi dan hidrolisis 4 kemudian menghasilkan asam 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksilat (disebut "asam kumotonat", 6) dalam hasil yang baik (70%, dua langkah). Akhirnya, amidasi melalui zat antara klorida asam 6 menggunakan amonia berair menghasilkan amida Kumamoto 1 dalam hasil 98%. Semua data spektral dari 1 yang disintesis serupa dengan 1 yang diisolasi, sehingga struktur 1 dapat ditentukan;
Sintesis umum dan analisis aktivitas biologis urbenamida dan asam urbenat. (a) Sintesis total amida Kumamoto. (b) Bibit Arabidopsis Columbia (Col) tipe liar berumur tujuh hari ditanam pada pelat Murashige dan Skoog (MS) yang mengandung kumamonamida 6 atau kumamonamida 1 pada konsentrasi yang ditunjukkan. Skala batang = 1 cm.
Pertama, kami menilai aktivitas biologis urbenamida dan zat antara untuk mengetahui kemampuannya dalam memodulasi pertumbuhan tanaman. Kami menambahkan berbagai konsentrasi ursmonamida 1 atau asam ursmonat 6 ke dalam media agar MS dan membudidayakan bibit Arabidopsis thaliana pada media ini. Pengujian ini menunjukkan bahwa konsentrasi tinggi (500 μM) 6 menghambat pertumbuhan akar (Gbr. 2b). Selanjutnya, kami menghasilkan berbagai turunan dengan mensubstitusi posisi N1 dari 6 dan melakukan studi hubungan struktur-aktivitas pada turunan tersebut (proses sintesis analog dijelaskan dalam Informasi Pendukung (SI)). Bibit Arabidopsis ditanam pada media yang mengandung 50 μM turunan asam ursonik, dan panjang akar diukur seperti yang ditunjukkan pada gambar. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3a, b, dan S1, asam kumamo memiliki panjang rantai alkoksi linier yang berbeda (9, 10, 11, 12, dan 13) atau rantai alkoksi besar (15, 16, dan 17) pada posisi N1. Turunannya menunjukkan penghambatan pertumbuhan akar yang signifikan. Selain itu, kami menemukan bahwa aplikasi 200 μM 10, 11, atau 17 menghambat perkecambahan (Gbr. 3c dan S2).
Studi tentang hubungan struktur-aktivitas amida Kumamoto dan senyawa terkait. (a) Struktur dan skema sintesis analog. (b) Kuantifikasi panjang akar bibit berumur 7 hari yang tumbuh pada media MS dengan atau tanpa turunan kumamonamida 50 μM. Tanda bintang menunjukkan perbedaan signifikan dengan perlakuan semu (uji t, p< 0,05).18. Data ditampilkan sebagai mean ± SD. nt berarti "tidak diuji" karena lebih dari 50% benih tidak berkecambah. (c) Kuantifikasi laju perkecambahan benih yang diinkubasi selama 7 hari dalam media MS dengan atau tanpa 200 μM coumamonamide dan senyawa terkait. Tanda bintang menunjukkan perbedaan signifikan dengan perlakuan semu (uji chi-square). n=96.
Menariknya, penambahan rantai samping alkil yang lebih panjang dari C9 mengurangi aktivitas penghambatan, menunjukkan bahwa senyawa terkait asam kumamotoat memerlukan rantai samping dengan ukuran tertentu untuk menunjukkan aktivitas biologisnya.
Karena analisis hubungan struktur-aktivitas menunjukkan bahwa C9 dimodifikasi menjadi asam ursonik dan turunan nonyloxy dari asam ursonik (selanjutnya disebut sebagai KAND 11) merupakan penghambat pertumbuhan tanaman yang paling efektif, kami melakukan karakterisasi KAND 11 yang lebih rinci. Perlakuan Arabidopsis dengan 50 μM KAND 11 hampir sepenuhnya mencegah perkecambahan, sedangkan konsentrasi yang lebih rendah (40, 30, 20, atau 10 μM) KAND 11 menghambat pertumbuhan akar secara bergantung dosis (Gbr. 4a, b). Untuk menguji apakah KAND 11 memengaruhi viabilitas meristem akar, kami memeriksa meristem akar yang diwarnai dengan propidium iodida (PI) dan mengukur ukuran area meristem. Ukuran meristem bibit yang tumbuh pada medium yang mengandung 25 μM KAND-11 adalah 151,1 ± 32,5 μm, sedangkan ukuran meristem bibit yang tumbuh pada medium kontrol yang mengandung DMSO adalah 264,7 ± 30,8 μm (Gbr. 4c, d), yang menunjukkan bahwa KAND-11 mengembalikan aktivitas seluler. penyebaran. Meristem akar. Konsisten dengan ini, perlakuan KAND 11 mengurangi jumlah sinyal penanda pembelahan sel CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS pada meristem akar (Gbr. 4e) 17 . Hasil ini menunjukkan bahwa KAND 11 menghambat pertumbuhan akar dengan mengurangi aktivitas proliferasi sel.
Analisis efek penghambatan turunan asam urbenonat (turunan urbenyloxy) terhadap pertumbuhan. (a) Bibit Col tipe liar berumur 7 hari yang ditanam pada pelat MS dengan konsentrasi KAND 11 yang ditunjukkan. Skala batang = 1 cm. (b) Kuantifikasi panjang akar. Huruf menunjukkan perbedaan yang signifikan (uji Tukey HSD, p< 0,05).16. Data ditampilkan sebagai mean ± SD. (c) Mikroskopi konfokal akar Col tipe liar yang diwarnai propidium iodida yang tumbuh pada pelat MS dengan atau tanpa 25 μM KAND 11. Tanda kurung putih menunjukkan meristem akar. Skala batang = 100 µm. (d) Kuantifikasi ukuran meristem akar (n = 10 hingga 11). Perbedaan statistik ditentukan menggunakan uji-t (p< 0,05). Batang-batang tersebut menunjukkan ukuran meristem rata-rata. (e) Mikroskopi kontras interferensi diferensial (DIC) dari meristem akar yang mengandung konstruksi CDKB2; 1pro: CDKB2; diwarnai dengan 1-GUS dan diwarnai pada bibit berumur 5 hari yang ditanam pada pelat MS dengan atau tanpa uji KAND 25 µM.
Fitotoksisitas KAND 11 selanjutnya diuji menggunakan tanaman dikotil lain, tembakau (Nicotiana tabacum), dan organisme model tanaman darat utama, lumut hati (Marchantia polymorpha). Seperti dalam kasus Arabidopsis, bibit tembakau SR-1 yang tumbuh pada media yang mengandung 25 μM KAND 11 menghasilkan akar yang lebih pendek (Gbr. 5a). Selain itu, 40 dari 48 benih berkecambah pada pelat yang mengandung 200 μM KAND 11, sedangkan semua 48 benih berkecambah pada media yang diberi perlakuan tiruan, yang menunjukkan bahwa konsentrasi KAND yang lebih tinggi signifikan (p< 0,05; uji chi-kuadrat) menghambat perkecambahan tembakau. (Gbr. 5b). Selain itu, konsentrasi KAND 11 yang menghambat pertumbuhan bakteri pada lumut hati mirip dengan konsentrasi efektif pada Arabidopsis (Gbr. 5c). Hasil ini menunjukkan bahwa KAND 11 dapat menghambat pertumbuhan berbagai tanaman. Kami kemudian menyelidiki kemungkinan sitotoksisitas senyawa terkait monoamida beruang pada organisme lain, yaitu sel HeLa manusia dan galur Escherichia coli DH5α, sebagai perwakilan sel hewan tingkat tinggi dan sel bakteri, masing-masing. Dalam serangkaian uji proliferasi sel, kami mengamati bahwa kumamonamida 1, asam kumamonamidik 6, dan KAND 11 tidak memengaruhi pertumbuhan sel HeLa atau E. coli pada konsentrasi 100 μM (Gbr. 5d,e).
Penghambatan pertumbuhan KAND 11 pada organisme non-Arabidopsis. (a) Bibit tembakau SR-1 tipe liar berumur dua minggu ditanam pada pelat MS yang diposisikan secara vertikal yang mengandung 25 μM KAND 11. (b) Bibit tembakau SR-1 tipe liar berumur dua minggu ditanam pada pelat MS yang diposisikan secara horizontal yang mengandung 200 μM KAND 11. (c) Tunas lumut hati Tak-1 tipe liar berumur dua minggu tumbuh pada pelat Gamborg B5 dengan konsentrasi KAND 11 yang ditunjukkan. Panah merah menunjukkan spora yang berhenti tumbuh dalam periode inkubasi dua minggu. (d) Uji proliferasi sel sel HeLa. Jumlah sel yang hidup diukur pada interval waktu yang tetap menggunakan kit penghitungan sel 8 (Dojindo). Sebagai kontrol, sel HeLa diobati dengan 5 μg/ml aktinomisin D (Act D), yang menghambat transkripsi RNA polimerase dan menyebabkan kematian sel. Analisis dilakukan dalam rangkap tiga. (e) Uji proliferasi sel E. coli. Pertumbuhan E. coli dianalisis dengan mengukur OD600. Sebagai kontrol, sel diobati dengan ampisilin (Amp) 50 μg/ml, yang menghambat sintesis dinding sel bakteri. Analisis dilakukan sebanyak tiga kali.
Untuk menguraikan mekanisme aksi sitotoksisitas yang disebabkan oleh senyawa terkait uramide, kami menganalisis ulang turunan asam urbenat dengan efek penghambatan sedang, seperti yang ditunjukkan pada gambar. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2b, 6a, bibit yang tumbuh pada pelat agar yang mengandung konsentrasi tinggi (200 μM) asam urmotonik 6 menghasilkan akar yang lebih pendek dan melengkung ke kiri (θ = – 23,7 ± 6,1), sedangkan bibit yang tumbuh pada media kontrol, bibit menghasilkan akar yang hampir lurus (θ = – 3,8 ± 7,1). Pertumbuhan miring yang khas ini diketahui disebabkan oleh disfungsi mikrotubulus kortikal14,18. Konsisten dengan temuan ini, obat pendestabil mikrotubulus disopiramid dan oryzalin menyebabkan kemiringan akar yang serupa dalam kondisi pertumbuhan kami (Gbr. 2b, 6a). Pada saat yang sama, kami menguji turunan asam urmotonik dan memilih beberapa di antaranya yang, pada konsentrasi tertentu, menginduksi pertumbuhan akar miring. Senyawa 8, 9, dan 15 mengubah arah pertumbuhan akar masing-masing pada 75 μM, 50 μM, dan 40 μM, yang menunjukkan bahwa senyawa ini dapat secara efektif mendestabilisasi mikrotubulus (Gbr. 2b, 6a). Kami juga menguji turunan asam ursolat yang paling kuat, KAND 11, pada konsentrasi yang lebih rendah (15 µM) dan menemukan bahwa aplikasi KAND 11 menghambat pertumbuhan akar dan arah pertumbuhan akar tidak merata, meskipun cenderung miring ke kiri (Gambar C3). . Karena konsentrasi obat destabilisasi mikrotubulus yang lebih tinggi terkadang menghambat pertumbuhan tanaman daripada menyebabkan kemiringan akar, kami kemudian menilai kemungkinan bahwa KAND 11 memengaruhi mikrotubulus dengan mengamati mikrotubulus kortikal dalam sel epidermis akar. Imunohistokimia menggunakan antibodi anti-β-tubulin pada sel epidermis akar semai yang diobati dengan 25 μM KAND 11 menunjukkan hilangnya hampir semua mikrotubulus kortikal pada sel epidermis di zona pemanjangan (Gbr. 6b). Hasil ini menunjukkan bahwa asam kumamotonik dan turunannya bekerja secara langsung atau tidak langsung pada mikrotubulus untuk mengganggunya dan bahwa senyawa ini merupakan penghambat mikrotubulus baru.
Asam ursonik dan turunannya mengubah mikrotubulus kortikal di Arabidopsis thaliana. (a) Sudut kemiringan akar diukur dengan adanya berbagai turunan asam urmotonik pada konsentrasi yang ditunjukkan. Efek dari dua senyawa yang diketahui menghambat mikrotubulus: disopiramid dan orizalin juga dianalisis. Sisipan menunjukkan standar yang digunakan untuk mengukur sudut pertumbuhan akar. Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan perlakuan semu (uji t, p< 0,05).19. Skala batang = 1 cm. (b) Mikrotubulus kortikal dalam sel epidermis di zona pemanjangan. Mikrotubulus dalam akar Arabidopsis Col tipe liar yang tumbuh pada pelat MS dengan atau tanpa 25 μM KAND 11 divisualisasikan dengan pewarnaan imunohistokimia menggunakan antibodi primer β-tubulin dan antibodi sekunder terkonjugasi Alexa Fluor. Skala batang = 10 µm. (c) Struktur mitosis mikrotubulus dalam meristem akar. Mikrotubulus divisualisasikan menggunakan pewarnaan imunohistokimia. Struktur mitosis, termasuk zona profase, spindel, dan phragmoplast, dihitung dari gambar konfokal. Anak panah menunjukkan struktur mikrotubulus mitosis. Tanda bintang menunjukkan perbedaan signifikan dengan perlakuan semu (uji t, p< 0,05).9. Skala batang = 50 µm.
Meskipun Ursa memiliki kemampuan untuk mengganggu fungsi mikrotubulus, mekanisme kerjanya diperkirakan berbeda dari agen depolymerisasi mikrotubulus yang umum. Misalnya, konsentrasi yang lebih tinggi dari agen depolymerisasi mikrotubulus seperti disopiramid dan oryzalin menginduksi ekspansi sel epidermis secara anisotropik, sedangkan KAND 11 tidak. Selain itu, aplikasi bersama KAND 11 dan disopiramid menghasilkan respons pertumbuhan akar gabungan yang diinduksi disopiramid dan penghambatan pertumbuhan yang diinduksi KAND 11 diamati (Gbr. S4). Kami juga menganalisis respons mutan disopiramid 1-1 (phs1-1) yang sangat sensitif terhadap KAND 11. phs1-1 memiliki mutasi titik kinase tubulin non-kanonik dan menghasilkan akar yang lebih pendek ketika diobati dengan disopiramid9,20. Bibit mutan phs1-1 yang tumbuh pada media agar yang mengandung KAND 11 memiliki akar yang lebih pendek mirip dengan yang tumbuh pada disopiramid (gbr. S5).
Selain itu, kami mengamati struktur mikrotubulus mitosis, seperti zona profase, spindel, dan phragmoplasts, dalam meristem akar bibit yang diobati dengan KAND 11. Konsisten dengan pengamatan untuk CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, penurunan signifikan dalam jumlah mikrotubulus mitosis diamati (Gbr. .6c).
Untuk mengkarakterisasi sitotoksisitas KAND 11 pada resolusi subseluler, kami memperlakukan sel suspensi tembakau BY-2 dengan KAND 11 dan mengamati responsnya. Kami pertama-tama menambahkan KAND 11 ke sel BY-2 yang mengekspresikan TagRFP-TUA6, yang memberi label fluoresensi pada mikrotubulus, untuk menilai efek KAND 11 pada mikrotubulus kortikal. Kepadatan mikrotubulus kortikal dinilai menggunakan analisis gambar, yang mengukur persentase piksel cytoskeletal di antara piksel sitoplasma. Hasil pengujian menunjukkan bahwa setelah perlakuan dengan 50 μM atau 100 μM KAND 11 selama 1 jam, kepadatan menurun secara signifikan menjadi 0,94 ± 0,74% atau 0,23 ± 0,28%, sedangkan kepadatan sel yang diobati dengan DMSO, berjumlah 1,61 ± 0,34% (Gbr. 7a). Hasil ini konsisten dengan pengamatan dalam Arabidopsis bahwa perlakuan KAND 11 menginduksi depolymerisasi mikrotubulus kortikal (Gbr. 6b). Kami juga memeriksa garis BY-2 dengan filamen aktin berlabel GFP-ABD setelah perlakuan dengan konsentrasi KAND 11 yang sama dan mengamati bahwa perlakuan KAND 11 mengganggu filamen aktin. Perlakuan dengan 50 μM atau 100 μM KAND 11 selama 1 jam secara signifikan mengurangi kepadatan filamen aktin menjadi 1,20 ± 0,62% atau 0,61 ± 0,26%, sedangkan kepadatan dalam sel yang diobati dengan DMSO adalah 1,69 ± 0,51% (Gbr. 2). 7b). Hasil-hasil ini kontras dengan efek propizamida, yang tidak memengaruhi filamen aktin, dan latrunculin B, depolymerizer aktin yang tidak memengaruhi mikrotubulus (SI Gambar S6). Selain itu, pengobatan dengan kumamonamida 1, asam kumamonamida 6, atau KAND 11 tidak memengaruhi mikrotubulus dalam sel HeLa (SI Gambar S7). Dengan demikian, mekanisme kerja KAND 11 diyakini berbeda dari pengganggu sitoskeleton yang diketahui. Selain itu, pengamatan mikroskopis kami terhadap sel-sel BY-2 yang diobati dengan KAND 11 mengungkapkan timbulnya kematian sel selama pengobatan KAND 11 dan menunjukkan bahwa proporsi sel mati yang diwarnai biru Evans tidak meningkat secara signifikan setelah 30 menit pengobatan KAND 11, sedangkan setelah 90 menit pengobatan dengan 50 μM atau 100 μM KAND, jumlah sel mati meningkat menjadi 43,7% atau 80,1%, masing-masing (Gbr. 7c). Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa turunan asam ursolat baru KAND 11 adalah penghambat sitoskeletal spesifik tanaman dengan mekanisme aksi yang sebelumnya tidak diketahui.
KAND memengaruhi mikrotubulus kortikal, filamen aktin, dan viabilitas sel BY-2 tembakau. (a) Visualisasi mikrotubulus kortikal dalam sel BY-2 dengan adanya TagRFP-TUA6. Sel BY-2 yang diobati dengan KAND 11 (50 μM atau 100 μM) atau DMSO diperiksa dengan mikroskopi konfokal. Kepadatan mikrotubulus kortikal dihitung dari mikrograf 25 sel independen. Huruf menunjukkan perbedaan yang signifikan (uji Tukey HSD, p< 0,05). Skala batang = 10 µm. (b) Filamen aktin kortikal pada sel BY-2 terlihat dengan adanya GFP-ABD2. Sel BY-2 yang diobati dengan KAND 11 (50 μM atau 100 μM) atau DMSO diperiksa dengan mikroskopi konfokal. Kepadatan filamen aktin kortikal dihitung dari mikrograf 25 sel independen. Huruf menunjukkan perbedaan yang signifikan (uji Tukey HSD, p< 0,05). Skala batang = 10 µm. (c) Pengamatan sel BY-2 yang mati dengan pewarnaan Evans blue. Sel BY-2 yang diobati dengan KAND 11 (50 μM atau 100 μM) atau DMSO diperiksa dengan mikroskop medan terang. n=3. Skala batang = 100 µm.
Penemuan dan penerapan produk alami baru telah menghasilkan kemajuan signifikan dalam berbagai aspek kehidupan manusia, termasuk pengobatan dan pertanian. Penelitian historis telah dilakukan untuk memperoleh senyawa bermanfaat dari sumber daya alam. Secara khusus, aktinomiset diketahui bermanfaat sebagai antibiotik antiparasit untuk nematoda karena kemampuannya menghasilkan berbagai metabolit sekunder seperti avermectin, senyawa utama ivermectin dan bleomycin serta turunannya, yang digunakan secara medis sebagai agen antikanker21,22. Demikian pula, berbagai senyawa herbisida telah ditemukan dari aktinomiset, beberapa di antaranya telah digunakan secara komersial1,23. Oleh karena itu, analisis metabolit aktinomiset untuk mengisolasi produk alami dengan aktivitas biologis yang diinginkan dianggap sebagai strategi yang efektif. Dalam penelitian ini, kami menemukan senyawa baru, kumamonamida, dari S. werraensis dan berhasil mensintesisnya. Asam ursonik merupakan zat antara sintetis urbenamida dan turunannya. Zat ini dapat menyebabkan akar melengkung, menunjukkan aktivitas herbisida sedang hingga kuat, dan secara langsung atau tidak langsung merusak mikrotubulus tanaman. Akan tetapi, mekanisme kerja asam urmotonik mungkin berbeda dari penghambat mikrotubulus yang ada, karena KAND 11 juga mengganggu filamen aktin dan menyebabkan kematian sel, yang menunjukkan adanya mekanisme pengaturan yang dengannya asam urmotonik dan turunannya memengaruhi berbagai struktur sitoskeletal.
Karakterisasi asam urbenonat yang lebih rinci akan membantu untuk lebih memahami mekanisme kerja asam urbenonat. Secara khusus, tujuan berikutnya adalah untuk mengevaluasi kemampuan asam ursonik untuk mengikat mikrotubulus yang tereduksi untuk menentukan apakah asam ursonik dan turunannya bekerja langsung pada mikrotubulus dan mendepolimerisasinya, atau apakah tindakannya mengakibatkan destabilisasi mikrotubulus. Selain itu, dalam kasus di mana mikrotubulus bukan merupakan target langsung, mengidentifikasi lokasi kerja dan target molekuler asam ursonik pada sel tanaman akan membantu lebih memahami sifat senyawa terkait dan kemungkinan cara untuk meningkatkan aktivitas herbisida. Uji bioaktivitas kami mengungkapkan kemampuan sitotoksik unik asam ursonik pada pertumbuhan tanaman seperti Arabidopsis thaliana, tembakau, dan lumut hati, sementara sel E. coli maupun HeLa tidak terpengaruh. Sedikit atau tidak ada toksisitas pada sel hewan merupakan keuntungan dari turunan asam ursonik jika dikembangkan sebagai herbisida untuk digunakan di lahan pertanian terbuka. Memang, karena mikrotubulus merupakan struktur umum pada eukariota, penghambatan selektifnya pada tanaman merupakan persyaratan utama untuk herbisida. Misalnya, propizamida, agen depolymerisasi mikrotubulus yang secara langsung mengikat tubulin dan menghambat polimerisasi, digunakan sebagai herbisida karena toksisitasnya yang rendah terhadap sel hewan24. Berbeda dengan disopiramida, benzamida terkait memiliki spesifisitas target yang berbeda. Selain mikrotubulus tanaman, RH-4032 atau benzoksamida juga menghambat mikrotubulus sel hewan atau oomycetes, dan zalilamida digunakan sebagai fungisida karena fitotoksisitasnya yang rendah25,26,27. Zat beruang yang baru ditemukan dan turunannya menunjukkan sitotoksisitas selektif terhadap tanaman, tetapi perlu dicatat bahwa modifikasi lebih lanjut dapat mengubah spesifisitas targetnya, yang berpotensi memberikan turunan tambahan untuk pengendalian jamur patogen atau oomycetes.
Sifat unik asam urbenonat dan turunannya bermanfaat untuk pengembangannya sebagai herbisida dan penggunaan sebagai alat penelitian. Pentingnya sitoskeleton dalam mengendalikan bentuk sel tanaman diakui secara luas. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa tanaman telah mengembangkan mekanisme kompleks organisasi mikrotubulus kortikal dengan mengendalikan dinamika mikrotubulus untuk mengendalikan morfogenesis dengan benar. Sejumlah besar molekul yang bertanggung jawab atas pengaturan aktivitas mikrotubulus telah diidentifikasi, dan penelitian terkait masih berlangsung3,4,28. Pemahaman kita saat ini tentang dinamika mikrotubulus dalam sel tanaman tidak sepenuhnya menjelaskan mekanisme organisasi mikrotubulus kortikal. Misalnya, meskipun disopiramid dan orizalin dapat mendepolimerisasi mikrotubulus, disopiramid menyebabkan distorsi akar yang parah sementara orizalin memiliki efek yang relatif ringan. Selain itu, mutasi pada tubulin, yang menstabilkan mikrotubulus, juga menyebabkan dekstrorotasi pada akar, sedangkan paclitaxel, yang juga menstabilkan dinamika mikrotubulus, tidak. Oleh karena itu, mempelajari dan mengidentifikasi target molekuler asam ursolat akan memberikan wawasan baru tentang regulasi mikrotubulus korteks tanaman. Demikian pula, perbandingan bahan kimia di masa mendatang yang efektif dalam mendorong pertumbuhan terdistorsi, seperti disopiramid, dan bahan kimia yang kurang efektif, seperti oryzalin atau asam kumamotorik, akan memberikan petunjuk tentang bagaimana pertumbuhan terdistorsi terjadi.
Di sisi lain, penataan ulang kerangka sel yang terkait dengan pertahanan merupakan kemungkinan lain untuk menjelaskan sitotoksisitas asam ursonik. Infeksi patogen atau pengenalan pemicu ke dalam sel tanaman terkadang menyebabkan kerusakan kerangka sel dan kematian sel berikutnya29. Misalnya, kriptoxantin yang berasal dari oomycete telah dilaporkan mengganggu mikrotubulus dan filamen aktin sebelum kematian sel tembakau, mirip dengan apa yang terjadi dengan pengobatan KAND30,31. Kesamaan antara respons pertahanan dan respons seluler yang diinduksi oleh asam ursonik membuat kami berhipotesis bahwa keduanya memicu proses seluler yang umum, meskipun efek asam ursonik yang lebih cepat dan lebih kuat daripada kriptoxantin terbukti. Namun, penelitian telah menunjukkan bahwa gangguan pada filamen aktin mendorong kematian sel spontan, yang tidak selalu disertai dengan gangguan mikrotubulus29. Selain itu, masih harus dilihat apakah patogen atau pemicu menyebabkan pertumbuhan akar yang terdistorsi, seperti yang terjadi pada turunan asam ursonik. Dengan demikian, pengetahuan molekuler yang menghubungkan respons pertahanan dan sitoskeleton merupakan masalah yang menarik untuk ditangani. Dengan memanfaatkan keberadaan senyawa dengan berat molekul rendah yang terkait dengan asam ursonik, serta berbagai turunan dengan potensi yang bervariasi, mereka dapat memberikan peluang untuk menargetkan mekanisme seluler yang tidak diketahui.
Secara keseluruhan, penemuan dan penerapan senyawa baru yang memodulasi dinamika mikrotubulus akan memberikan metode yang ampuh untuk mengatasi mekanisme molekuler kompleks yang mendasari penentuan bentuk sel tanaman. Dalam konteks ini, senyawa asam urmotonik yang baru dikembangkan, yang memengaruhi mikrotubulus dan filamen aktin serta menginduksi kematian sel, dapat memberikan peluang untuk menguraikan hubungan antara kontrol mikrotubulus dan mekanisme lainnya ini. Dengan demikian, analisis kimia dan biologi menggunakan asam urbenonik akan membantu kita memahami mekanisme pengaturan molekuler yang mengendalikan sitoskeleton tanaman.
Inokulasikan S. werraensis MK493-CF1 ke dalam labu Erlenmeyer berpenyekat 500 mL yang berisi 110 mL media benih yang terdiri dari 2% (b/v) galaktosa, 2% (b/v) pasta Essence, 1% (b/v) komposisi Bacto. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (b/v) ekstrak jagung (KOGOSTCH Co., Ltd., Jepang), 0,2% (b/v) (NH4)2SO4 dan 0,2% CaCO3 dalam air deionisasi. (pH 7,4 sebelum sterilisasi). Kultur benih diinkubasi pada pengocok putar (180 rpm) pada suhu 27°C selama 2 hari. Produksi budidaya melalui fermentasi keadaan padat. Kultur benih (7 ml) dipindahkan ke dalam labu K-1 500 ml yang berisi 40 g media produksi yang terdiri dari 15 g jelai yang dipadatkan (MUSO Co., Ltd., Jepang) dan 25 g air deionisasi (pH tidak disesuaikan sebelum sterilisasi). Fermentasi dilakukan pada suhu 30°C dalam gelap selama 14 hari. Bahan fermentasi diekstraksi dengan 40 ml/botol EtOH dan disentrifugasi (1500 g, 4°C, 10 menit). Supernatan kultur (60 ml) diekstraksi dengan campuran 10% MeOH/EtOAc. Lapisan organik diuapkan di bawah tekanan rendah untuk memperoleh residu (59,5 mg), yang dikenakan pada HPLC dengan elusi gradien (0–10 menit: 90%) pada kolom fase terbalik (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × panjang 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 menit: 90% H2O/CH3CN hingga 70% H2O/CH3CN (gradien), 35–45 menit: 90% H2O/EtOH, 45–155 menit: 90% H2O/EtOH hingga 100% EtOH (gradien (gradien), 155–200 menit: 100% EtOH) pada laju alir 1,5 ml/menit, kumamonamida (1, 36,0 mg) diisolasi sebagai bubuk amorf putih.
Kumamotoamida(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ nilai hitung: 141,0659, nilai ukur: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Benih Columbia (Col-0) diperoleh dari Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) dengan izin untuk penggunaan penelitian. Benih Col-0 diperbanyak dan dipelihara di bawah kondisi laboratorium kami dan digunakan sebagai tanaman Arabidopsis tipe liar. Benih Arabidopsis disterilkan permukaannya dan dikultur dalam medium Murashige dan Skoog setengah kekuatan yang mengandung 2% sukrosa (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (b/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) dan 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, pada suhu 23 °C dan cahaya konstan. Benih mutan phs1-1 disediakan oleh T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Benih galur SR-1 disediakan oleh T. Hashimoto (Institut Sains dan Teknologi Nara) dan digunakan sebagai tanaman tembakau liar. Benih tembakau disterilkan permukaannya dan direndam dalam air steril selama tiga malam untuk meningkatkan perkecambahan, kemudian ditempatkan dalam larutan setengah kekuatan yang mengandung 2% sukrosa, 0,05% (b/v) MES, dan 0,8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. dan Skoog medium) dengan pH 5,7 dan diinkubasi pada suhu 23°C di bawah cahaya konstan.
Galur Tak-1 disediakan oleh T. Kohchi (Universitas Kyoto) dan digunakan sebagai unit eksperimen standar untuk studi lumut hati. Gemma diperoleh dari tanaman kultur yang disterilkan dan kemudian ditanam pada media Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) yang mengandung 1% sukrosa dan 0,3% gellan gum dan diinkubasi pada suhu 23°C di bawah cahaya terus-menerus.
Sel BY-2 tembakau (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) disediakan oleh S. Hasezawa (Universitas Tokyo). Sel BY-2 diencerkan 95 kali lipat dalam medium Linsmeier dan Skoog yang dimodifikasi dan ditambah seminggu sekali dengan asam 2,4-diklorofenoksiasetat 32 . Suspensi sel dicampur pada pengocok putar pada 130 rpm pada 27°C dalam gelap. Cuci sel dengan 10 kali volume medium baru dan suspensikan kembali dalam medium yang sama. Lini sel transgenik BY-2 yang mengekspresikan penanda mikrotubulus TagRFP-TUA6 atau penanda filamen aktin GFP-ABD2 secara stabil di bawah promotor virus mosaik kembang kol 35S dihasilkan seperti yang dijelaskan33,34,35. Lini sel ini dapat dipelihara dan disinkronkan menggunakan prosedur yang serupa dengan yang digunakan untuk lini sel BY-2 asli.
Sel HeLa dikultur dalam medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) yang dilengkapi dengan 10% serum janin sapi, 1,2 U/ml penisilin, dan 1,2 μg/ml streptomisin dalam inkubator 37°C dengan 5% CO2.
Semua percobaan yang dijelaskan dalam naskah ini dilakukan sesuai dengan peraturan dan pedoman biosafety Jepang.
Senyawa dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) sebagai larutan stok dan diencerkan dalam media MS untuk Arabidopsis dan tembakau atau media Gamborg B5 untuk lumut hati. Untuk uji penghambatan pertumbuhan akar, lebih dari 10 biji per piring ditaburkan pada media agar yang mengandung senyawa yang ditunjukkan atau DMSO. Benih diinkubasi dalam ruang pertumbuhan selama 7 hari. Bibit difoto dan panjang akar diukur. Untuk uji perkecambahan Arabidopsis, 48 biji per piring ditaburkan pada media agar yang mengandung senyawa 200 μM atau DMSO. Benih Arabidopsis ditanam dalam ruang pertumbuhan dan jumlah bibit yang berkecambah dihitung 7 hari setelah perkecambahan (dag). Untuk uji perkecambahan tembakau, 24 biji per piring ditaburkan pada media agar yang mengandung KAND 200 μM atau DMSO. Benih tembakau ditanam dalam ruang pertumbuhan dan jumlah bibit yang berkecambah dihitung setelah 14 hari. Untuk pengujian penghambatan pertumbuhan lumut hati, 9 embrio dari setiap lempeng ditanam pada media agar berisi konsentrasi KAND atau DMSO yang ditunjukkan dan diinkubasi dalam ruang pertumbuhan selama 14 hari.
Gunakan bibit yang diwarnai dengan 5 mg/ml propidium iodida (PI) untuk memvisualisasikan organisasi meristem akar. Sinyal PI diamati dengan mikroskop fluoresensi menggunakan mikroskop pemindai laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
Pewarnaan histokimia akar dengan β-glukuronidase (GUS) dilakukan sesuai dengan protokol yang dijelaskan oleh Malami dan Benfey36. Bibit difiksasi dalam 90% aseton semalaman, diwarnai dengan 0,5 mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-indolyl-β-d-asam glukuronat dalam buffer GUS selama 1 jam dan ditempatkan dalam larutan kloraldehida terhidrasi. (8 g kloral hidrat, 2 ml air dan 1 ml gliserol) dan diamati dengan mikroskop kontras interferensi diferensial menggunakan mikroskop Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Sudut akar diukur pada bibit berumur 7 hari yang ditanam pada pelat yang ditempatkan secara vertikal. Ukur sudut akar dari arah vektor gravitasi seperti yang dijelaskan pada langkah 6.
Susunan mikrotubulus kortikal diamati seperti yang dijelaskan, dengan sedikit modifikasi pada protokol 37 . Antibodi anti-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) dan anti-mouse IgG terkonjugasi Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) digunakan sebagai antibodi primer dan sekunder pada pengenceran 1:1000 dan 1:100, masing-masing. Gambar fluoresensi diperoleh menggunakan mikroskop pemindai laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems). Dapatkan gambar tumpukan Z dan buat proyeksi intensitas maksimum sesuai dengan petunjuk pabrik.
Uji proliferasi sel HeLa dilakukan menggunakan Cell Counting Kit 8 (Dojindo) sesuai dengan petunjuk pabrik.
Pertumbuhan E. coli DH5α dianalisis dengan mengukur kepadatan sel dalam kultur menggunakan spektrofotometer pada 600 nm (OD600).
Organisasi sitoskeletal dalam sel BY-2 transgenik diamati menggunakan mikroskop fluoresensi yang dilengkapi dengan perangkat pemindaian confocal CSU-X1 (Yokogawa) dan kamera sCMOS (Zyla, Andor Technology). Kepadatan sitoskeletal dinilai dengan analisis gambar, yang mengukur persentase piksel sitoskeletal di antara piksel sitoplasma dalam gambar confocal menggunakan perangkat lunak ImageJ seperti yang dijelaskan38,39.
Untuk mendeteksi kematian sel pada sel BY-2, sebagian kecil suspensi sel diinkubasi dengan 0,05% Evans blue selama 10 menit pada suhu ruangan. Pewarnaan Evans blue selektif pada sel yang mati bergantung pada ekstrusi pewarna dari sel yang hidup oleh membran plasma yang utuh40. Sel yang diwarnai diamati menggunakan mikroskop medan terang (BX53, Olympus).
Sel HeLa ditumbuhkan dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10% FBS dalam inkubator humidifikasi pada suhu 37°C dan 5% CO2. Sel diperlakukan dengan 100 μM KAND 11, asam kumamonamic 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), atau 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) selama 6 jam pada suhu 37°C. Sel difiksasi dengan MetOH selama 10 menit dan kemudian dengan asetat selama 5 menit pada suhu kamar. Sel yang difiksasi diinkubasi dengan antibodi primer β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) yang diencerkan dalam 0,5% BSA/PBS selama 2 jam, dicuci 3 kali dengan TBST, dan kemudian diinkubasi dengan antibodi kambing Alexa Fluor. 488 1 jam. – Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) dan 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) yang diencerkan dalam 0,5% BSA/PBS. Setelah dicuci dengan TBST tiga kali, sel yang diwarnai diamati pada mikroskop terbalik Nikon Eclipse Ti-E. Gambar diambil dengan kamera CCD Hamamatsu ORCA-R2 yang didinginkan menggunakan perangkat lunak MetaMorph (Molecular Devices).
Waktu posting: 17-Jun-2024