Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi peramban yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk hasil terbaik, sebaiknya gunakan versi peramban yang lebih baru (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami menampilkan situs ini tanpa gaya atau JavaScript.
Penemuan dan pemanfaatan produk alami yang bermanfaat dapat membantu meningkatkan kualitas hidup manusia. Bahan kimia penghambat pertumbuhan tanaman banyak digunakan sebagai herbisida untuk mengendalikan gulma. Karena kebutuhan akan berbagai jenis herbisida, diperlukan identifikasi senyawa dengan mekanisme kerja baru. Dalam studi ini, kami menemukan senyawa N-alkoksipirol baru, kumamonamida, dari Streptomyces werraensis MK493-CF1 dan menetapkan proses sintesis yang lengkap. Melalui uji aktivitas biologis, kami menemukan bahwa asam urs-monoamida merupakan zat antara sintetis dari urs-monoamida dan merupakan senyawa potensial.penghambat pertumbuhan tanamanSelain itu, kami telah mengembangkan berbagai turunan asam urbenonat, termasuk turunan urbeniloksi (UDA), yang memiliki aktivitas herbisida tinggi tanpa berdampak negatif pada pertumbuhan sel HeLa. Kami juga menemukan bahwa turunan asam urmotonik mengganggu mikrotubulus tanaman; selain itu, KAND memengaruhi filamen aktin dan menginduksi kematian sel; Efek multifaset ini berbeda dari inhibitor mikrotubulus yang telah diketahui dan menunjukkan mekanisme kerja baru untuk asam ursonik, yang merupakan keuntungan penting dalam pengembangan herbisida baru.
Penemuan dan penerapan praktis produk alami yang bermanfaat dan turunannya merupakan cara untuk meningkatkan kualitas hidup manusia. Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikroorganisme, tumbuhan, dan serangga telah menghasilkan kemajuan pesat di bidang kedokteran dan pertanian. Banyak antibiotik dan obat anti-leukemia telah dikembangkan dari produk alami. Selain itu, berbagai jenispestisidaFungisida dan herbisida diekstraksi dari produk alami ini untuk digunakan dalam pertanian. Khususnya, herbisida pengendali gulma merupakan alat penting untuk meningkatkan hasil panen dalam pertanian modern, dan berbagai jenis senyawa telah digunakan secara komersial. Beberapa proses seluler pada tumbuhan, seperti fotosintesis, metabolisme asam amino, sintesis dinding sel, regulasi mitosis, pensinyalan fitohormon, atau sintesis protein, dianggap sebagai target umum herbisida. Senyawa yang menghambat fungsi mikrotubulus merupakan golongan herbisida umum yang memengaruhi pertumbuhan tanaman dengan memengaruhi regulasi mitosis.2
Mikrotubulus merupakan komponen sitoskeleton dan secara luas terkonservasi dalam sel eukariotik. Heterodimer tubulin terdiri dari α-tubulin dan β-tubulin yang membentuk protofilamen mikrotubulus linear, dengan 13 protofilamen membentuk struktur silinder. Mikrotubulus memainkan berbagai peran dalam sel tumbuhan, termasuk menentukan bentuk sel, pembelahan sel, dan transportasi intraseluler3,4. Sel tumbuhan mengandung mikrotubulus di bawah membran plasma interfase, dan yang disebut mikrotubulus kortikal ini diperkirakan mengendalikan organisasi mikrofibril selulosa melalui regulasi kompleks selulosa sintase4,5. Mikrotubulus kortikal sel epidermis akar, yang terdapat di zona pemanjangan cepat ujung akar, terletak di lateral, dan serat mikro selulosa mengikuti mikrotubulus ini dan membatasi arah ekspansi sel, sehingga mendorong pemanjangan sel anisotropik. Oleh karena itu, fungsi mikrotubulus berkaitan erat dengan morfologi tumbuhan. Substitusi asam amino pada gen pengkode tubulin menyebabkan kemiringan susunan mikrotubulus kortikal dan pertumbuhan sisi kiri atau kanan pada Arabidopsis (6,7). Demikian pula, mutasi pada protein terkait mikrotubulus yang mengatur dinamika mikrotubulus juga dapat menyebabkan pertumbuhan akar yang terdistorsi (8,9,10,11,12,13). Selain itu, perlakuan dengan herbisida pengganggu mikrotubulus seperti disopiramid, juga dikenal sebagai pretilaklor, juga menyebabkan pertumbuhan akar miring ke kiri (14). Data ini menunjukkan bahwa pengaturan fungsi mikrotubulus yang tepat sangat penting untuk menentukan arah pertumbuhan tanaman.
Berbagai jenis inhibitor mikrotubulus telah ditemukan, dan obat-obatan ini telah memberikan kontribusi yang signifikan bagi penelitian sitoskeletal, serta pertanian dan kedokteran2. Khususnya, oryzalin, senyawa dinitroanilin, disopiramid, senyawa terkait benzamida, dan analognya dapat menghambat fungsi mikrotubulus dan dengan demikian menghambat pertumbuhan tanaman. Oleh karena itu, senyawa-senyawa ini banyak digunakan sebagai herbisida. Namun, karena mikrotubulus merupakan komponen penting sel tumbuhan dan hewan, sebagian besar inhibitor mikrotubulus bersifat sitotoksik terhadap kedua jenis sel tersebut. Oleh karena itu, meskipun manfaatnya sebagai herbisida telah diakui, hanya sedikit agen antimikrotubulus yang digunakan untuk tujuan praktis.
Streptomyces adalah genus dari famili Streptomyces, yang mencakup bakteri aerob, gram positif, dan berfilamen, serta dikenal luas karena kemampuannya menghasilkan beragam metabolit sekunder. Oleh karena itu, Streptomyces dianggap sebagai salah satu sumber terpenting produk alami baru yang aktif secara biologis. Dalam penelitian ini, kami menemukan senyawa baru yang disebut kumamonamida, yang diisolasi dari Streptomyces werraensis MK493-CF1 dan S. werraensis ISP 5486. Menggunakan analisis spektral dan analisis spektral penuh, struktur kumamonamida dikarakterisasi dan kerangka N-alkoksipirolnya yang unik ditentukan. Asam ursmonat, suatu zat antara sintetis ursmonoamida dan turunannya, ditemukan mampu menghambat pertumbuhan dan perkecambahan tanaman model populer Arabidopsis thaliana. Dalam studi hubungan struktur-aktivitas, kami menemukan bahwa senyawa dengan C9 yang dimodifikasi menjadi asam ursonik, yang disebut turunan noniloksi asam ursonik (KAND), secara signifikan meningkatkan efek penghambatan pada pertumbuhan dan perkecambahan. Khususnya, inhibitor pertumbuhan tanaman yang baru ditemukan ini juga memengaruhi pertumbuhan tembakau dan lumut hati serta tidak bersifat sitotoksik terhadap bakteri maupun sel HeLa. Lebih lanjut, beberapa turunan asam ursonik menginduksi fenotipe akar yang terdistorsi, yang menyiratkan bahwa turunan ini secara langsung maupun tidak langsung memengaruhi mikrotubulus. Konsisten dengan gagasan ini, pengamatan kami terhadap mikrotubulus yang diberi label imunohistokimia atau dengan protein fluoresen menunjukkan bahwa perlakuan KAND mendepolimerisasi mikrotubulus. Selain itu, perlakuan dengan turunan asam kumamotonik mengganggu mikrofilamen aktin. Dengan demikian, kami telah menemukan inhibitor pertumbuhan tanaman baru yang mekanisme kerjanya yang unik melibatkan penghancuran sitoskeleton.
Galur MK493-CF1 diisolasi dari tanah di Shinagawa-ku, Tokyo. Galur MK493-CF1 membentuk miselium stroma bercabang baik. Urutan parsial gen RNA ribosom 16S (1422 bp) telah ditentukan. Galur ini sangat mirip dengan S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: galur tipikal, 99,93%). Berdasarkan hasil ini, ditentukan bahwa galur ini berkerabat dekat dengan galur tipe S. werraensis. Oleh karena itu, untuk sementara kami menamai galur ini S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T juga menghasilkan senyawa bioaktif yang sama. Karena penelitian awal untuk mendapatkan produk alami dari mikroorganisme ini masih terbatas, penelitian kimia lebih lanjut dilakukan. Setelah budidaya S. werraensis MK493-CF1 pada media jelai dengan fermentasi padat pada suhu 30°C selama 14 hari, media tersebut diekstraksi dengan 50% EtOH. Sebanyak 60 ml sampel dikeringkan untuk mendapatkan 59,5 mg ekstrak kasar. Ekstrak kasar tersebut kemudian dianalisa dengan HPLC fase terbalik untuk menghasilkan N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamida (1, yang disebut kumamonamida, 36,0 mg). Jumlah total 1 kira-kira 60% dari ekstrak kasar. Oleh karena itu, kami memutuskan untuk mempelajari secara detail sifat-sifat kumamotoamida 1.
Kumamonamida 1 adalah bubuk amorf putih dan spektrometri massa resolusi tinggi (HRESIMS) mengonfirmasi C6H8N2O2 (Gbr. 1). Fragmen pirol tersubstitusi C2 dari senyawa ini dicirikan oleh δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH dalam spektrum NMR 1H: 4,5 Hz, H-5) dan δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), dan spektrum NMR 13C menunjukkan keberadaan empat atom karbon sp2. Keberadaan gugus amida pada posisi C2 dinilai dengan korelasi HMBC dari proton C-3 ke karbon karbonil amida pada δC 161,1. Selain itu, puncak NMR 1H dan 13C pada δH 4,10 (3H, S) dan δC 68,3 menunjukkan keberadaan gugus N-metoksi dalam molekul tersebut. Meskipun posisi gugus metoksi yang tepat belum ditentukan menggunakan analisis spektroskopi seperti spektroskopi perbedaan yang disempurnakan dan singkatan Overhauser nuklir (NOEDF), N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamida menjadi kandidat senyawa pertama.
Untuk menentukan struktur yang tepat dari 1, sintesis total dilakukan (Gambar 2a). Perlakuan 2-aminopiridina 2 yang tersedia secara komersial dengan m-CPBA menghasilkan N-oksida 3 yang sesuai dalam rendemen kuantitatif. Setelah 2-aminoazidasi 2, reaksi siklokondensasi yang dijelaskan oleh Abramovich dilakukan dalam benzena pada suhu 90°C untuk memperoleh 1-hidroksi-1H-pirol-2-karbonitril 5 yang diinginkan dalam gram. Kecepatan 60% (dua tahap). 15,16. Metilasi dan hidrolisis 4 kemudian menghasilkan asam 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksilat (disebut "asam kumotonat", 6) dengan rendemen yang baik (70%, dua tahap). Akhirnya, amidasi melalui zat antara klorida asam 6 menggunakan amonia cair menghasilkan amida Kumamoto 1 dengan rendemen 98%. Semua data spektral dari 1 yang disintesis serupa dengan 1 yang diisolasi, sehingga struktur 1 dapat ditentukan;
Sintesis umum dan analisis aktivitas biologis urbenamida dan asam urbenat. (a) Sintesis total amida Kumamoto. (b) Bibit Arabidopsis Columbia (Col) tipe liar berumur tujuh hari ditanam pada cawan Murashige dan Skoog (MS) yang mengandung kumamonamida 6 atau kumamonamida 1 pada konsentrasi yang ditunjukkan. Skala batang = 1 cm.
Pertama, kami menilai aktivitas biologis urbenamida dan zat antara untuk kemampuannya memodulasi pertumbuhan tanaman. Kami menambahkan berbagai konsentrasi ursmonamida 1 atau asam ursmonat 6 ke dalam media agar MS dan mengkulturkan bibit Arabidopsis thaliana pada media ini. Hasil pengujian menunjukkan bahwa konsentrasi tinggi (500 μM) 6 menghambat pertumbuhan akar (Gambar 2b). Selanjutnya, kami menghasilkan berbagai turunan dengan mensubstitusi posisi N1 pada 6 dan melakukan studi hubungan struktur-aktivitas pada turunan tersebut (proses sintesis analog dijelaskan dalam Informasi Tambahan (SI)). Bibit Arabidopsis ditumbuhkan pada media yang mengandung 50 μM turunan asam ursmonat, dan panjang akar diukur seperti yang ditunjukkan pada gambar. Seperti ditunjukkan pada Gambar 3a, b, dan S1, asam kumamo memiliki panjang rantai alkoksi linear yang berbeda (9, 10, 11, 12, dan 13) atau rantai alkoksi panjang (15, 16, dan 17) pada posisi N1. Turunan tersebut menunjukkan penghambatan pertumbuhan akar yang signifikan. Selain itu, kami menemukan bahwa aplikasi 200 μM 10, 11, atau 17 menghambat perkecambahan (Gambar 3c dan S2).
Studi hubungan struktur-aktivitas amida Kumamoto dan senyawa terkait. (a) Struktur dan skema sintesis analog. (b) Kuantifikasi panjang akar bibit berumur 7 hari yang ditanam pada media MS dengan atau tanpa turunan kumamonamida 50 μM. Tanda bintang menunjukkan perbedaan signifikan dengan perlakuan semu (uji t, p< 0,05).18. Data ditampilkan sebagai rerata ± SD. nt berarti "tidak diuji" karena lebih dari 50% benih tidak berkecambah. (c) Kuantifikasi laju perkecambahan benih yang diberi perlakuan dan diinkubasi selama 7 hari dalam media MS dengan atau tanpa 200 μM kumamonamida dan senyawa terkait. Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan perlakuan semu (uji chi-kuadrat). n=96.
Menariknya, penambahan rantai samping alkil yang lebih panjang dari C9 mengurangi aktivitas penghambatan, menunjukkan bahwa senyawa terkait asam kumamotoat memerlukan rantai samping dengan ukuran tertentu untuk menunjukkan aktivitas biologisnya.
Karena analisis hubungan struktur-aktivitas menunjukkan bahwa C9 dimodifikasi menjadi asam ursonik dan turunan noniloksi dari asam ursonik (selanjutnya disebut KAND 11) merupakan penghambat pertumbuhan tanaman yang paling efektif, kami melakukan karakterisasi KAND 11 yang lebih detail. Perlakuan Arabidopsis dengan 50 μM KAND 11 hampir sepenuhnya mencegah perkecambahan, sementara konsentrasi yang lebih rendah (40, 30, 20, atau 10 μM) KAND 11 menghambat pertumbuhan akar secara bergantung dosis (Gambar 4a, b). Untuk menguji apakah KAND 11 memengaruhi viabilitas meristem akar, kami memeriksa meristem akar yang diwarnai dengan propidium iodida (PI) dan mengukur luas area meristem. Ukuran meristem bibit yang tumbuh pada media yang mengandung 25 μM KAND-11 adalah 151,1 ± 32,5 μm, sedangkan ukuran meristem bibit yang tumbuh pada media kontrol yang mengandung DMSO adalah 264,7 ± 30,8 μm (Gbr. 4c, d), yang menunjukkan bahwa KAND-11 memulihkan aktivitas seluler. menyebar. Meristem akar. Konsisten dengan ini, perlakuan KAND 11 mengurangi jumlah sinyal penanda pembelahan sel CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS pada meristem akar (Gbr. 4e) 17 . Hasil ini menunjukkan bahwa KAND 11 menghambat pertumbuhan akar dengan mengurangi aktivitas proliferasi sel.
Analisis efek penghambatan turunan asam urbenonat (turunan urbeniloksi) terhadap pertumbuhan. (a) Bibit Col tipe liar berumur 7 hari yang ditanam pada cawan MS dengan konsentrasi KAND 11 yang ditunjukkan. Skala batang = 1 cm. (b) Kuantifikasi panjang akar. Huruf menunjukkan perbedaan yang signifikan (uji Tukey HSD, p< 0,05).16. Data ditampilkan sebagai rerata ± SD. (c) Mikroskopi konfokal akar Col tipe liar yang diwarnai propidium iodida yang tumbuh pada pelat MS dengan atau tanpa KAND 25 μM 11. Tanda kurung putih menunjukkan meristem akar. Skala batang = 100 µm. (d) Kuantifikasi ukuran meristem akar (n = 10 hingga 11). Perbedaan statistik ditentukan menggunakan uji-t (p< 0,05). Batang-batang tersebut mewakili ukuran meristem rata-rata. (e) Mikroskopi kontras interferensi diferensial (DIC) meristem akar yang mengandung konstruk CDKB2; 1pro: CDKB2; diwarnai 1-GUS dan diwarnai pada bibit berumur 5 hari yang ditanam pada pelat MS dengan atau tanpa uji KAND 25 µM.
Fitotoksisitas KAND 11 diuji lebih lanjut menggunakan tanaman dikotil lain, tembakau (Nicotiana tabacum), dan organisme model tanaman darat utama, lumut hati (Marchantia polymorpha). Sebagaimana pada kasus Arabidopsis, bibit tembakau SR-1 yang ditanam pada media yang mengandung 25 μM KAND 11 menghasilkan akar yang lebih pendek (Gambar 5a). Selain itu, 40 dari 48 biji berkecambah pada cawan yang mengandung 200 μM KAND 11, sementara semua 48 biji berkecambah pada media yang diberi perlakuan tiruan, menunjukkan bahwa konsentrasi KAND yang lebih tinggi signifikan (p< 0,05; uji chi-kuadrat) menghambat perkecambahan tembakau. (Gbr. 5b). Selain itu, konsentrasi KAND 11 yang menghambat pertumbuhan bakteri pada lumut hati serupa dengan konsentrasi efektif pada Arabidopsis (Gbr. 5c). Hasil ini menunjukkan bahwa KAND 11 dapat menghambat pertumbuhan berbagai tanaman. Kami kemudian menyelidiki kemungkinan sitotoksisitas senyawa terkait monoamida beruang pada organisme lain, yaitu sel HeLa manusia dan Escherichia coli galur DH5α, masing-masing sebagai perwakilan sel hewan tingkat tinggi dan sel bakteri. Dalam serangkaian uji proliferasi sel, kami mengamati bahwa kumamonamida 1, asam kumamonamidik 6, dan KAND 11 tidak memengaruhi pertumbuhan sel HeLa atau E. coli pada konsentrasi 100 μM (Gbr. 5d,e).
Penghambatan pertumbuhan KAND 11 pada organisme non-Arabidopsis. (a) Bibit tembakau SR-1 tipe liar berumur dua minggu ditanam pada pelat MS yang diposisikan secara vertikal berisi 25 μM KAND 11. (b) Bibit tembakau SR-1 tipe liar berumur dua minggu ditanam pada pelat MS yang diposisikan secara horizontal berisi 200 μM KAND 11. (c) Tunas lumut hati Tak-1 tipe liar berumur dua minggu tumbuh pada pelat Gamborg B5 dengan konsentrasi KAND 11 yang ditunjukkan. Panah merah menunjukkan spora yang berhenti tumbuh dalam periode inkubasi dua minggu. (d) Uji proliferasi sel sel HeLa. Jumlah sel yang hidup diukur pada interval waktu yang tetap menggunakan kit penghitungan sel 8 (Dojindo). Sebagai kontrol, sel HeLa diobati dengan 5 μg/ml aktinomisin D (Act D), yang menghambat transkripsi RNA polimerase dan menyebabkan kematian sel. Analisis dilakukan dalam rangkap tiga. (e) Uji proliferasi sel E. coli. Pertumbuhan E. coli dianalisis dengan mengukur OD600. Sebagai kontrol, sel diberi perlakuan ampisilin (Amp) 50 μg/ml, yang menghambat sintesis dinding sel bakteri. Analisis dilakukan dalam rangkap tiga.
Untuk menguraikan mekanisme kerja sitotoksisitas yang disebabkan oleh senyawa terkait uramide, kami menganalisis ulang turunan asam urbenat dengan efek penghambatan sedang, seperti yang ditunjukkan pada gambar. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2b, 6a, bibit yang tumbuh pada pelat agar yang mengandung konsentrasi tinggi (200 μM) asam urmotonik 6 menghasilkan akar yang lebih pendek dan melengkung ke kiri (θ = – 23,7 ± 6,1), sedangkan bibit yang tumbuh pada media kontrol, bibit menghasilkan akar yang hampir lurus (θ = – 3,8 ± 7,1). Pertumbuhan miring yang khas ini diketahui disebabkan oleh disfungsi mikrotubulus kortikal14,18. Konsisten dengan temuan ini, obat-obatan destabilisasi mikrotubulus disopiramid dan oryzalin menginduksi kemiringan akar yang serupa dalam kondisi pertumbuhan kami (Gbr. 2b, 6a). Pada saat yang sama, kami menguji turunan asam urmotonik dan memilih beberapa di antaranya yang, pada konsentrasi tertentu, menginduksi pertumbuhan akar miring. Senyawa 8, 9, dan 15 mengubah arah pertumbuhan akar masing-masing pada 75 μM, 50 μM, dan 40 μM, yang menunjukkan bahwa senyawa ini dapat secara efektif mendestabilisasi mikrotubulus (Gbr. 2b, 6a). Kami juga menguji turunan asam ursolat yang paling kuat, KAND 11, pada konsentrasi yang lebih rendah (15 µM) dan menemukan bahwa aplikasi KAND 11 menghambat pertumbuhan akar dan arah pertumbuhan akar tidak merata, meskipun cenderung miring ke kiri (Gambar C3). . Karena konsentrasi obat destabilisasi mikrotubulus yang lebih tinggi terkadang menghambat pertumbuhan tanaman daripada menyebabkan kemiringan akar, kami kemudian menilai kemungkinan bahwa KAND 11 memengaruhi mikrotubulus dengan mengamati mikrotubulus kortikal dalam sel epidermis akar. Imunohistokimia menggunakan antibodi anti-β-tubulin pada sel epidermis akar kecambah yang diberi perlakuan KAND 11 25 μM menunjukkan hilangnya hampir semua mikrotubulus kortikal pada sel epidermis di zona pemanjangan (Gambar 6b). Hasil ini menunjukkan bahwa asam kumamotonik dan turunannya bekerja secara langsung maupun tidak langsung pada mikrotubulus untuk mengganggunya, dan bahwa senyawa-senyawa ini merupakan inhibitor mikrotubulus yang baru.
Asam ursonik dan turunannya mengubah mikrotubulus kortikal pada Arabidopsis thaliana. (a) Sudut inklinasi akar diukur dengan adanya berbagai turunan asam urmotonik pada konsentrasi yang ditunjukkan. Efek dari dua senyawa yang diketahui menghambat mikrotubulus: disopiramid dan orizalin, juga dianalisis. Sisipan menunjukkan standar yang digunakan untuk mengukur sudut pertumbuhan akar. Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan perlakuan semu (uji t, p< 0,05).19. Skala batang = 1 cm. (b) Mikrotubulus kortikal dalam sel epidermis di zona pemanjangan. Mikrotubulus pada akar Arabidopsis Col tipe liar yang tumbuh pada pelat MS dengan atau tanpa KAND 11 25 μM divisualisasikan melalui pewarnaan imunohistokimia menggunakan antibodi primer β-tubulin dan antibodi sekunder terkonjugasi Alexa Fluor. Skala batang = 10 µm. (c) Struktur mitosis mikrotubulus dalam meristem akar. Mikrotubulus divisualisasikan menggunakan pewarnaan imunohistokimia. Struktur mitosis, termasuk zona profase, spindel, dan fragmoplas, dihitung dari gambar konfokal. Panah menunjukkan struktur mikrotubulus mitosis. Tanda bintang menunjukkan perbedaan signifikan dengan perlakuan semu (uji t, p< 0,05).9. Skala batang = 50 µm.
Meskipun Ursa memiliki kemampuan untuk mengganggu fungsi mikrotubulus, mekanisme kerjanya diperkirakan berbeda dari agen depolymerisasi mikrotubulus pada umumnya. Misalnya, konsentrasi agen depolymerisasi mikrotubulus yang lebih tinggi seperti disopiramid dan oryzalin menginduksi ekspansi sel epidermis secara anisotropik, sedangkan KAND 11 tidak. Selain itu, aplikasi bersama KAND 11 dan disopiramid menghasilkan respons pertumbuhan akar gabungan yang diinduksi disopiramid dan penghambatan pertumbuhan yang diinduksi KAND 11 yang teramati (Gbr. S4). Kami juga menganalisis respons mutan disopiramid 1-1 (phs1-1) yang hipersensitif terhadap KAND 11. phs1-1 memiliki mutasi titik kinase tubulin non-kanonik dan menghasilkan akar yang lebih pendek ketika diobati dengan disopiramid9,20. Bibit mutan phs1-1 yang tumbuh pada media agar yang mengandung KAND 11 memiliki akar yang lebih pendek, serupa dengan yang tumbuh pada disopiramid (Gbr. S5).
Selain itu, kami mengamati struktur mikrotubulus mitosis, seperti zona profase, spindel, dan phragmoplast, di meristem akar bibit yang diberi perlakuan KAND 11. Konsisten dengan pengamatan untuk CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, penurunan signifikan dalam jumlah mikrotubulus mitosis diamati (Gbr. 6c).
Untuk mengkarakterisasi sitotoksisitas KAND 11 pada resolusi subseluler, kami memperlakukan sel suspensi tembakau BY-2 dengan KAND 11 dan mengamati responsnya. Kami pertama-tama menambahkan KAND 11 ke sel BY-2 yang mengekspresikan TagRFP-TUA6, yang memberi label fluoresensi pada mikrotubulus, untuk mengkaji efek KAND 11 pada mikrotubulus kortikal. Kepadatan mikrotubulus kortikal dinilai menggunakan analisis citra, yang mengkuantifikasi persentase piksel sitoskeletal di antara piksel sitoplasma. Hasil pengujian menunjukkan bahwa setelah perlakuan dengan 50 μM atau 100 μM KAND 11 selama 1 jam, kepadatan menurun secara signifikan menjadi 0,94 ± 0,74% atau 0,23 ± 0,28%, sementara kepadatan sel yang diobati dengan DMSO, berjumlah 1,61 ± 0,34% (Gbr. 7a). Hasil ini konsisten dengan pengamatan pada Arabidopsis bahwa perlakuan KAND 11 menginduksi depolimerisasi mikrotubulus kortikal (Gambar 6b). Kami juga memeriksa galur BY-2 dengan filamen aktin berlabel GFP-ABD setelah perlakuan dengan konsentrasi KAND 11 yang sama dan mengamati bahwa perlakuan KAND 11 mengganggu filamen aktin. Perlakuan dengan 50 μM atau 100 μM KAND 11 selama 1 jam secara signifikan mengurangi kepadatan filamen aktin menjadi 1,20 ± 0,62% atau 0,61 ± 0,26%, sedangkan kepadatan pada sel yang diberi perlakuan DMSO adalah 1,69 ± 0,51% (Gambar 2). 7b). Hasil-hasil ini kontras dengan efek propizamide, yang tidak memengaruhi filamen aktin, dan latrunculin B, depolymerizer aktin yang tidak memengaruhi mikrotubulus (SI Gambar S6). Selain itu, pengobatan dengan coumamonamide 1, coumamonamide acid 6, atau KAND 11 tidak memengaruhi mikrotubulus dalam sel HeLa (SI Gambar S7). Dengan demikian, mekanisme kerja KAND 11 diyakini berbeda dari pengganggu sitoskeleton yang diketahui. Selain itu, pengamatan mikroskopis kami terhadap sel-sel BY-2 yang diobati dengan KAND 11 mengungkapkan timbulnya kematian sel selama pengobatan KAND 11 dan menunjukkan bahwa proporsi sel mati yang diwarnai biru Evans tidak meningkat secara signifikan setelah 30 menit pengobatan KAND 11, sedangkan setelah 90 menit pengobatan dengan 50 μM atau 100 μM KAND, jumlah sel mati meningkat menjadi 43,7% atau 80,1%, masing-masing (Gbr. 7c). Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa turunan asam ursolat baru KAND 11 adalah penghambat sitoskeletal spesifik tanaman dengan mekanisme aksi yang sebelumnya tidak diketahui.
KAND memengaruhi mikrotubulus kortikal, filamen aktin, dan viabilitas sel BY-2 tembakau. (a) Visualisasi mikrotubulus kortikal pada sel BY-2 dengan adanya TagRFP-TUA6. Sel BY-2 yang diberi KAND 11 (50 μM atau 100 μM) atau DMSO diperiksa dengan mikroskop konfokal. Kepadatan mikrotubulus kortikal dihitung dari mikrograf 25 sel independen. Huruf menunjukkan perbedaan yang signifikan (uji Tukey HSD, p< 0,05). Skala batang = 10 µm. (b) Filamen aktin kortikal pada sel BY-2 divisualisasikan dengan adanya GFP-ABD2. Sel BY-2 yang diberi perlakuan KAND 11 (50 μM atau 100 μM) atau DMSO diperiksa dengan mikroskop konfokal. Kepadatan filamen aktin kortikal dihitung dari mikrograf 25 sel independen. Huruf menunjukkan perbedaan yang signifikan (uji Tukey HSD, p< 0,05). Skala batang = 10 µm. (c) Pengamatan sel BY-2 yang mati dengan pewarnaan biru Evans. Sel BY-2 yang diberi KAND 11 (50 μM atau 100 μM) atau DMSO diperiksa dengan mikroskop medan terang. n=3. Skala batang = 100 µm.
Penemuan dan penerapan produk alami baru telah menghasilkan kemajuan signifikan dalam berbagai aspek kehidupan manusia, termasuk kedokteran dan pertanian. Penelitian historis telah dilakukan untuk mendapatkan senyawa bermanfaat dari sumber daya alam. Secara khusus, aktinomiset diketahui bermanfaat sebagai antibiotik antiparasit untuk nematoda karena kemampuannya menghasilkan berbagai metabolit sekunder seperti avermectin, senyawa utama ivermectin dan bleomisin serta turunannya, yang digunakan secara medis sebagai agen antikanker21,22. Demikian pula, berbagai senyawa herbisida telah ditemukan dari aktinomiset, beberapa di antaranya telah digunakan secara komersial1,23. Oleh karena itu, analisis metabolit aktinomiset untuk mengisolasi produk alami dengan aktivitas biologis yang diinginkan dianggap sebagai strategi yang efektif. Dalam penelitian ini, kami menemukan senyawa baru, kumamonamida, dari S. werraensis dan berhasil mensintesisnya. Asam ursonik merupakan zat antara sintetis urbenamida dan turunannya. Zat ini dapat menyebabkan pengeritingan akar yang khas, menunjukkan aktivitas herbisida sedang hingga kuat, dan secara langsung maupun tidak langsung merusak mikrotubulus tanaman. Namun, mekanisme kerja asam urmotonik mungkin berbeda dari inhibitor mikrotubulus yang ada, karena KAND 11 juga mengganggu filamen aktin dan menyebabkan kematian sel, menunjukkan adanya mekanisme regulasi yang memengaruhi beragam struktur sitoskeletal oleh asam urmotonik dan turunannya.
Karakterisasi asam urbenonat yang lebih rinci akan membantu pemahaman yang lebih baik tentang mekanisme kerja asam urbenonat. Tujuan selanjutnya adalah mengevaluasi kemampuan asam ursonik untuk berikatan dengan mikrotubulus yang tereduksi guna menentukan apakah asam ursonik dan turunannya bekerja langsung pada mikrotubulus dan mendepolimerisasinya, atau apakah aksinya mengakibatkan destabilisasi mikrotubulus. Selain itu, dalam kasus di mana mikrotubulus bukan target langsung, mengidentifikasi lokasi aksi dan target molekuler asam ursonik pada sel tanaman akan membantu pemahaman lebih lanjut tentang sifat-sifat senyawa terkait dan kemungkinan cara untuk meningkatkan aktivitas herbisida. Uji bioaktivitas kami mengungkapkan kemampuan sitotoksik unik asam ursonik terhadap pertumbuhan tanaman seperti Arabidopsis thaliana, tembakau, dan lumut hati, sementara sel E. coli maupun HeLa tidak terpengaruh. Rendahnya atau tidak adanya toksisitas terhadap sel hewan merupakan keuntungan dari turunan asam ursonik jika dikembangkan sebagai herbisida untuk digunakan di lahan pertanian terbuka. Memang, karena mikrotubulus merupakan struktur umum pada eukariota, penghambatan selektifnya pada tumbuhan merupakan syarat utama herbisida. Misalnya, propizamida, agen depolimerisasi mikrotubulus yang secara langsung mengikat tubulin dan menghambat polimerisasi, digunakan sebagai herbisida karena toksisitasnya yang rendah terhadap sel hewan24. Berbeda dengan disopiramida, benzamida terkait memiliki spesifisitas target yang berbeda. Selain mikrotubulus tumbuhan, RH-4032 atau benzoksamida juga menghambat mikrotubulus sel hewan atau oomycetes, dan zalilamida digunakan sebagai fungisida karena fitotoksisitasnya yang rendah25,26,27. Zalilamida yang baru ditemukan dan turunannya menunjukkan sitotoksisitas selektif terhadap tumbuhan, tetapi perlu dicatat bahwa modifikasi lebih lanjut dapat mengubah spesifisitas targetnya, yang berpotensi menghasilkan turunan tambahan untuk pengendalian jamur patogen atau oomycetes.
Sifat unik asam urbenonat dan turunannya bermanfaat untuk pengembangannya sebagai herbisida dan penggunaannya sebagai alat penelitian. Pentingnya sitoskeleton dalam mengendalikan bentuk sel tumbuhan telah diakui secara luas. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa tumbuhan telah mengembangkan mekanisme kompleks organisasi mikrotubulus kortikal dengan mengendalikan dinamika mikrotubulus untuk mengendalikan morfogenesis dengan tepat. Sejumlah besar molekul yang bertanggung jawab atas regulasi aktivitas mikrotubulus telah diidentifikasi, dan penelitian terkait masih berlangsung3,4,28. Pemahaman kita saat ini tentang dinamika mikrotubulus dalam sel tumbuhan belum sepenuhnya menjelaskan mekanisme organisasi mikrotubulus kortikal. Misalnya, meskipun disopiramid dan orizalin dapat mendepolimerisasi mikrotubulus, disopiramid menyebabkan distorsi akar yang parah sementara orizalin memiliki efek yang relatif ringan. Lebih lanjut, mutasi pada tubulin, yang menstabilkan mikrotubulus, juga menyebabkan dekstrorotasi pada akar, sedangkan paklitaksel, yang juga menstabilkan dinamika mikrotubulus, tidak. Oleh karena itu, mempelajari dan mengidentifikasi target molekuler asam ursolat akan memberikan wawasan baru tentang regulasi mikrotubulus korteks tanaman. Demikian pula, perbandingan di masa mendatang antara zat kimia yang efektif dalam mendorong pertumbuhan terdistorsi, seperti disopiramid, dan zat kimia yang kurang efektif, seperti orizalin atau asam kumamotorik, akan memberikan petunjuk tentang bagaimana pertumbuhan terdistorsi terjadi.
Di sisi lain, penataan ulang sitoskeletal yang berkaitan dengan pertahanan merupakan kemungkinan lain untuk menjelaskan sitotoksisitas asam ursonik. Infeksi patogen atau pengenalan elisitor ke dalam sel tanaman terkadang menyebabkan kerusakan sitoskeleton dan kematian sel berikutnya29. Sebagai contoh, kriptoksantin turunan oomycete telah dilaporkan mengganggu mikrotubulus dan filamen aktin sebelum kematian sel tembakau, serupa dengan yang terjadi pada perlakuan KAND30,31. Kesamaan antara respons pertahanan dan respons seluler yang diinduksi oleh asam ursonik mendorong kami untuk berhipotesis bahwa keduanya memicu proses seluler yang umum, meskipun efek asam ursonik yang lebih cepat dan lebih kuat daripada kriptoksantin terbukti. Namun, penelitian telah menunjukkan bahwa gangguan pada filamen aktin mendorong kematian sel spontan, yang tidak selalu disertai dengan gangguan mikrotubulus29. Selain itu, masih harus dilihat apakah patogen atau elisitor menyebabkan pertumbuhan akar yang terdistorsi, seperti yang terjadi pada turunan asam ursonik. Oleh karena itu, pengetahuan molekuler yang menghubungkan respons pertahanan dan sitoskeleton merupakan masalah yang menarik untuk dibahas. Dengan memanfaatkan keberadaan senyawa berbobot molekul rendah yang berkaitan dengan asam ursonik, serta berbagai turunannya dengan potensi yang bervariasi, hal ini dapat memberikan peluang untuk menargetkan mekanisme seluler yang belum diketahui.
Secara keseluruhan, penemuan dan penerapan senyawa baru yang memodulasi dinamika mikrotubulus akan menghasilkan metode yang ampuh untuk memahami mekanisme molekuler kompleks yang mendasari penentuan bentuk sel tumbuhan. Dalam konteks ini, senyawa asam urmotonik yang baru dikembangkan, yang memengaruhi mikrotubulus dan filamen aktin serta menginduksi kematian sel, dapat memberikan peluang untuk menguraikan hubungan antara kontrol mikrotubulus dan mekanisme lainnya. Dengan demikian, analisis kimia dan biologi menggunakan asam urbenonat akan membantu kita memahami mekanisme regulasi molekuler yang mengendalikan sitoskeleton tumbuhan.
Inokulasikan S. werraensis MK493-CF1 ke dalam labu Erlenmeyer berpenyekat 500 mL berisi 110 mL media benih yang terdiri dari 2% (b/v) galaktosa, 2% (b/v) pasta Essence, 1% (b/v) komposisi Bacto. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (b/v) ekstrak jagung (KOGOSTCH Co., Ltd., Jepang), 0,2% (b/v) (NH4)2SO4, dan 0,2% CaCO3 dalam air deionisasi. (pH 7,4 sebelum sterilisasi). Kultur benih diinkubasi pada pengocok putar (180 rpm) pada suhu 27°C selama 2 hari. Kultur produksi dilakukan melalui fermentasi padatan. Kultur benih (7 ml) dipindahkan ke dalam labu K-1 500 ml berisi 40 g media produksi yang terdiri dari 15 g jelai pres (MUSO Co., Ltd., Jepang) dan 25 g air deionisasi (pH belum disesuaikan sebelum sterilisasi). Fermentasi dilakukan pada suhu 30°C dalam gelap selama 14 hari. Bahan fermentasi diekstraksi dengan 40 ml/botol EtOH dan disentrifugasi (1500 g, 4°C, 10 menit). Supernatan kultur (60 ml) diekstraksi dengan campuran 10% MeOH/EtOAc. Lapisan organik diuapkan di bawah tekanan rendah untuk memperoleh residu (59,5 mg), yang dikenakan pada HPLC dengan elusi gradien (0–10 menit: 90%) pada kolom fase terbalik (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × panjang 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 menit: 90% H2O/CH3CN hingga 70% H2O/CH3CN (gradien), 35–45 menit: 90% H2O/EtOH, 45–155 menit: 90% H2O/EtOH hingga 100% EtOH (gradien (gradien), 155–200 menit: 100% EtOH) pada laju alir 1,5 ml/menit, kumamonamida (1, 36,0 mg) diisolasi sebagai bubuk amorf putih.
Kumamotoamida(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ nilai terhitung: 141,0659, nilai terukur: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Benih Columbia (Col-0) diperoleh dari Pusat Sumber Daya Biologi Arabidopsis (ABRC) dengan izin untuk penelitian. Benih Col-0 diperbanyak dan dipelihara di bawah kondisi laboratorium kami dan digunakan sebagai tanaman Arabidopsis tipe liar. Benih Arabidopsis disterilkan permukaannya dan dikultur dalam medium Murashige dan Skoog setengah konsentrasi yang mengandung 2% sukrosa (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (b/v) asam 2-(4-morfolino)etansulfonat (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical), dan 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, pada suhu 23 °C dan cahaya konstan. Benih mutan phs1-1 disediakan oleh T. Hashimoto (Institut Sains dan Teknologi Nara).
Benih galur SR-1 disediakan oleh T. Hashimoto (Institut Sains dan Teknologi Nara) dan digunakan sebagai tanaman tembakau tipe liar. Benih tembakau disterilkan permukaannya dan direndam dalam air steril selama tiga malam untuk mendorong perkecambahan, kemudian ditempatkan dalam larutan setengah konsentrasi yang mengandung 2% sukrosa, 0,05% (b/v) MES, dan 0,8% gellan gum (media Fujifilm Wako Pure Chemical, Murashige, dan Skoog) dengan pH 5,7 dan diinkubasi pada suhu 23°C di bawah cahaya konstan.
Galur Tak-1 disediakan oleh T. Kohchi (Universitas Kyoto) dan digunakan sebagai unit eksperimen standar untuk studi lumut hati. Gemma diperoleh dari tanaman kultur steril, kemudian ditanam pada media Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) yang mengandung 1% sukrosa dan 0,3% gelan gum, dan diinkubasi pada suhu 23°C di bawah cahaya kontinu.
Sel BY-2 tembakau (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) disediakan oleh S. Hasezawa (Universitas Tokyo). Sel BY-2 diencerkan 95 kali lipat dalam medium Linsmeier dan Skoog yang dimodifikasi dan disuplementasi mingguan dengan asam 2,4-diklorofenoksiasetat. Suspensi sel diaduk menggunakan rotary shaker dengan kecepatan 130 rpm pada suhu 27°C dalam kondisi gelap. Cuci sel dengan 10 kali volume medium segar dan suspensikan kembali dalam medium yang sama. Lini sel transgenik BY-2 yang mengekspresikan penanda mikrotubulus TagRFP-TUA6 atau penanda filamen aktin GFP-ABD2 secara stabil di bawah promotor 35S virus mosaik kembang kol dihasilkan sebagaimana dijelaskan. Lini sel ini dapat dipelihara dan disinkronkan menggunakan prosedur yang serupa dengan yang digunakan untuk lini sel BY-2 asli.
Sel HeLa dikultur dalam medium Dulbecco yang dimodifikasi Eagle (DMEM) (Life Technologies) yang dilengkapi dengan 10% serum janin sapi, 1,2 U/ml penisilin, dan 1,2 μg/ml streptomisin dalam inkubator 37°C dengan 5% CO2.
Semua percobaan yang dijelaskan dalam naskah ini dilakukan sesuai dengan peraturan dan pedoman biosafety Jepang.
Senyawa dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) sebagai larutan stok dan diencerkan dalam media MS untuk Arabidopsis dan tembakau atau media Gamborg B5 untuk lumut hati. Untuk uji penghambatan pertumbuhan akar, lebih dari 10 biji per cawan ditabur pada media agar yang mengandung senyawa yang ditunjukkan atau DMSO. Biji diinkubasi dalam ruang pertumbuhan selama 7 hari. Bibit difoto dan panjang akar diukur. Untuk uji perkecambahan Arabidopsis, 48 biji per cawan ditabur pada media agar yang mengandung senyawa 200 μM atau DMSO. Biji Arabidopsis ditanam dalam ruang pertumbuhan dan jumlah bibit yang berkecambah dihitung 7 hari setelah perkecambahan (dag). Untuk uji perkecambahan tembakau, 24 biji per cawan ditabur pada media agar yang mengandung KAND 200 μM atau DMSO. Biji tembakau ditanam dalam ruang pertumbuhan dan jumlah bibit yang berkecambah dihitung setelah 14 hari. Untuk pengujian penghambatan pertumbuhan lumut hati, 9 embrio dari setiap lempeng ditanam pada media agar yang mengandung konsentrasi KAND atau DMSO yang ditunjukkan dan diinkubasi dalam ruang pertumbuhan selama 14 hari.
Gunakan bibit yang diwarnai dengan propidium iodida (PI) 5 mg/ml untuk memvisualisasikan organisasi meristem akar. Sinyal PI diamati dengan mikroskop fluoresensi menggunakan mikroskop pemindai laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
Pewarnaan histokimia akar dengan β-glukuronidase (GUS) dilakukan sesuai protokol yang dijelaskan oleh Malami dan Benfey36. Bibit difiksasi dalam aseton 90% semalaman, diwarnai dengan 0,5 mg/ml asam 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-d-glukuronat dalam buffer GUS selama 1 jam, dan ditempatkan dalam larutan kloraldehida terhidrasi (8 g kloral hidrat, 2 ml air, dan 1 ml gliserol) dan diamati dengan mikroskop kontras interferensi diferensial menggunakan mikroskop Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Sudut akar diukur pada bibit berumur 7 hari yang ditanam pada pelat vertikal. Ukur sudut akar dari arah vektor gravitasi seperti yang dijelaskan pada langkah 6.
Susunan mikrotubulus kortikal diamati sebagaimana dijelaskan, dengan sedikit modifikasi pada protokol 37 . Antibodi anti-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) dan IgG anti-tikus terkonjugasi Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) digunakan sebagai antibodi primer dan sekunder dengan pengenceran masing-masing 1:1000 dan 1:100. Citra fluoresensi diperoleh menggunakan mikroskop pemindai laser konfokal TCS SPE (Leica Microsystems). Dapatkan citra Z-stack dan buat proyeksi intensitas maksimum sesuai dengan petunjuk produsen.
Pengujian proliferasi sel HeLa dilakukan menggunakan Cell Counting Kit 8 (Dojindo) sesuai dengan petunjuk pabrik.
Pertumbuhan E. coli DH5α dianalisis dengan mengukur kepadatan sel dalam kultur menggunakan spektrofotometer pada 600 nm (OD600).
Organisasi sitoskeletal dalam sel BY-2 transgenik diamati menggunakan mikroskop fluoresensi yang dilengkapi dengan perangkat pemindai confocal CSU-X1 (Yokogawa) dan kamera sCMOS (Zyla, Andor Technology). Kepadatan sitoskeletal dinilai melalui analisis citra, yang mengkuantifikasi persentase piksel sitoskeletal di antara piksel sitoplasma dalam citra confocal menggunakan perangkat lunak ImageJ sebagaimana dijelaskan38,39.
Untuk mendeteksi kematian sel pada sel BY-2, sebagian suspensi sel diinkubasi dengan 0,05% Evans blue selama 10 menit pada suhu ruangan. Pewarnaan Evans blue selektif pada sel mati bergantung pada ekstrusi pewarna dari sel yang hidup oleh membran plasma yang utuh40. Sel yang diwarnai diamati menggunakan mikroskop medan terang (BX53, Olympus).
Sel HeLa ditumbuhkan dalam DMEM yang disuplementasi dengan 10% FBS dalam inkubator yang dilembabkan pada suhu 37°C dan 5% CO2. Sel diberi perlakuan dengan 100 μM KAND 11, asam kumamonamat 6, kumamonamida 1, 100 ng/ml kolsemid (Gibco), atau 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) selama 6 jam pada suhu 37°C. Sel difiksasi dengan MetOH selama 10 menit dan kemudian dengan asetat selama 5 menit pada suhu ruang. Sel yang difiksasi diinkubasi dengan antibodi primer β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) yang diencerkan dalam 0,5% BSA/PBS selama 2 jam, dicuci 3 kali dengan TBST, dan kemudian diinkubasi dengan antibodi kambing Alexa Fluor. 488 1 jam. – IgG tikus (Thermo Fisher Scientific: A11001) dan 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) yang diencerkan dalam 0,5% BSA/PBS. Setelah dicuci dengan TBST tiga kali, sel yang diwarnai diamati menggunakan mikroskop terbalik Nikon Eclipse Ti-E. Gambar diambil dengan kamera CCD Hamamatsu ORCA-R2 yang didinginkan menggunakan perangkat lunak MetaMorph (Molecular Devices).
Waktu posting: 17-Jun-2024