Terima kasih telah mengunjungi Nature.com.Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas.Untuk hasil terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan versi browser yang lebih baru (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami menampilkan situs tanpa gaya atau JavaScript.
Penemuan dan pemanfaatan produk alami dapat membantu meningkatkan kehidupan manusia.Bahan kimia penghambat pertumbuhan tanaman banyak digunakan sebagai herbisida untuk mengendalikan gulma.Karena kebutuhan untuk menggunakan berbagai jenis herbisida, terdapat kebutuhan untuk mengidentifikasi senyawa dengan mekanisme kerja baru.Dalam penelitian ini, kami menemukan senyawa N -alkoxypyrrole baru, coumamonamide, dari Streptomyces werraensis MK493-CF1 dan menetapkan proses sintesis lengkap.Melalui uji aktivitas biologis, kami menemukan bahwa asam urs-monoamat adalah zat antara sintetik dari urs-monoamida dan potensipenghambat pertumbuhan tanaman.Selain itu, kami telah mengembangkan berbagai turunan asam urbenonat, termasuk turunan urbeniloksi (UDA), yang memiliki aktivitas herbisida tinggi tanpa memberikan dampak negatif terhadap pertumbuhan sel HeLa.Kami juga menemukan bahwa turunan asam urmotonik mengganggu mikrotubulus tanaman;selain itu, KAND mempengaruhi filamen aktin dan menginduksi kematian sel;Efek multifaset ini berbeda dari inhibitor mikrotubulus yang diketahui dan menyarankan mekanisme kerja asam ursonik baru, yang mewakili keuntungan penting dalam pengembangan herbisida baru.
Penemuan dan penerapan praktis produk alam yang bermanfaat serta turunannya merupakan sarana untuk meningkatkan kualitas hidup manusia.Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikroorganisme, tumbuhan dan serangga telah membawa kemajuan besar dalam bidang kedokteran dan pertanian.Banyak antibiotik dan obat anti leukemia telah dikembangkan dari produk alami.Selain itu, berbagai jenispestisida, fungisida dan herbisida diekstraksi dari produk alami ini untuk digunakan dalam pertanian.Secara khusus, herbisida pengendalian gulma merupakan alat penting untuk meningkatkan hasil panen dalam pertanian modern, dan berbagai jenis senyawa sudah digunakan secara komersial.Beberapa proses seluler pada tumbuhan, seperti fotosintesis, metabolisme asam amino, sintesis dinding sel, regulasi mitosis, sinyal fitohormon, atau sintesis protein, dianggap sebagai target khas herbisida.Senyawa yang menghambat fungsi mikrotubulus adalah kelas umum herbisida yang mempengaruhi pertumbuhan tanaman dengan mempengaruhi regulasi mitosis2.
Mikrotubulus adalah komponen sitoskeleton dan banyak disimpan dalam sel eukariotik.Heterodimer tubulin terdiri dari α-tubulin dan β-tubulin yang membentuk protofilamen mikrotubulus linier, dengan 13 protofilamen membentuk struktur silinder.Mikrotubulus memainkan banyak peran dalam sel tumbuhan, termasuk menentukan bentuk sel, pembelahan sel, dan transportasi intraseluler3,4.Sel tumbuhan mengandung mikrotubulus di bawah membran plasma interfase, dan mikrotubulus kortikal ini diperkirakan mengendalikan organisasi mikrofibril selulosa melalui regulasi kompleks selulosa sintase4,5.Mikrotubulus kortikal sel epidermis akar, terdapat di zona pemanjangan cepat ujung akar, terletak di lateral, dan serat mikro selulosa mengikuti mikrotubulus ini dan membatasi arah ekspansi sel, sehingga mendorong pemanjangan sel anisotropik.Oleh karena itu, fungsi mikrotubulus erat kaitannya dengan morfologi tumbuhan.Substitusi asam amino pada gen yang mengkode tubulin menyebabkan kemiringan susunan mikrotubulus kortikal dan pertumbuhan sisi kiri atau kanan pada Arabidopsis 6,7.Demikian pula, mutasi pada protein terkait mikrotubulus yang mengatur dinamika mikrotubulus juga dapat menyebabkan distorsi pertumbuhan akar8,9,10,11,12,13.Selain itu, pengobatan dengan herbisida pengganggu mikrotubulus seperti disopyramide, juga dikenal sebagai pretilachlor, juga menyebabkan pertumbuhan akar miring ke kiri14.Data ini menunjukkan bahwa pengaturan fungsi mikrotubulus yang tepat sangat penting untuk menentukan arah pertumbuhan tanaman.
Berbagai jenis penghambat mikrotubulus telah ditemukan, dan obat-obatan ini telah memberikan kontribusi yang signifikan terhadap penelitian sitoskeletal, serta pertanian dan kedokteran2.Secara khusus, oryzalin, senyawa dinitroanilin, disopyramide, senyawa terkait benzamida, dan analognya dapat menghambat fungsi mikrotubulus sehingga menghambat pertumbuhan tanaman.Oleh karena itu, mereka banyak digunakan sebagai herbisida.Namun, karena mikrotubulus merupakan komponen penting sel tumbuhan dan hewan, sebagian besar inhibitor mikrotubulus bersifat sitotoksik terhadap kedua jenis sel.Oleh karena itu, meskipun kegunaannya sebagai herbisida, sejumlah agen antimikrotubulus digunakan untuk tujuan praktis.
Streptomyces adalah genus dari keluarga Streptomyces, yang mencakup bakteri aerobik, gram positif, berfilamen dan dikenal luas karena kemampuannya menghasilkan berbagai metabolit sekunder.Oleh karena itu, ini dianggap sebagai salah satu sumber terpenting produk alami baru yang aktif secara biologis.Dalam penelitian saat ini, kami menemukan senyawa baru yang disebut coumamonamide, yang diisolasi dari Streptomyces werraensis MK493-CF1 dan S. werraensis ISP 5486. Dengan menggunakan analisis spektral dan analisis spektral penuh, struktur coumamonamide dikarakterisasi dan kerangka N-alkoxypyrrole yang unik telah ditentukan.perpaduan.Asam ursmonat, zat antara sintetik ursmonoamida dan turunannya, ditemukan menghambat pertumbuhan dan perkecambahan tanaman model Arabidopsis thaliana yang populer.Dalam studi hubungan struktur-aktivitas, kami menemukan bahwa senyawa dengan C9 yang dimodifikasi menjadi asam ursonik, yang disebut turunan noniloksi asam ursonik (KAND), secara signifikan meningkatkan efek penghambatan pada pertumbuhan dan perkecambahan.Khususnya, penghambat pertumbuhan tanaman yang baru ditemukan ini juga mempengaruhi pertumbuhan tembakau dan lumut hati serta tidak bersifat sitotoksik terhadap bakteri atau sel HeLa.Selain itu, beberapa turunan asam urmotonik menginduksi fenotip akar yang terdistorsi, yang menyiratkan bahwa turunan ini secara langsung atau tidak langsung mempengaruhi mikrotubulus.Konsisten dengan gagasan ini, pengamatan kami terhadap mikrotubulus yang diberi label imunohistokimia atau dengan protein fluoresen menunjukkan bahwa pengobatan KAND mendepolimerisasi mikrotubulus.Selain itu, pengobatan dengan turunan asam kumamotonic mengganggu mikrofilamen aktin.Oleh karena itu, kami telah menemukan penghambat pertumbuhan tanaman baru yang mekanisme kerjanya unik melibatkan penghancuran sitoskeleton.
Strain MK493-CF1 diisolasi dari tanah di Shinagawa-ku, Tokyo.Strain MK493-CF1 membentuk miselium stroma bercabang baik.Urutan parsial gen RNA ribosom 16S (1422 bp) ditentukan.Strain ini sangat mirip dengan S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: strain tipikal, 99,93%).Berdasarkan hasil tersebut, diketahui bahwa strain tersebut berkerabat dekat dengan strain tipe S. werraensis.Oleh karena itu, kami untuk sementara menamai strain ini S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T juga menghasilkan senyawa bioaktif yang sama.Karena hanya ada sedikit penelitian awal untuk memperoleh produk alami dari mikroorganisme ini, penelitian kimia lebih lanjut pun dilakukan.Setelah budidaya S. werraensis MK493-CF1 pada medium barley dengan fermentasi solid-state pada suhu 30°C selama 14 hari, medium tersebut diekstraksi dengan 50% EtOH.60 ml sampel dikeringkan sehingga diperoleh 59,5 mg ekstrak kasar.Ekstrak kasar dikenai HPLC fase terbalik untuk menghasilkan N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamida (1, bernama coumamonamide, 36,0 mg).Jumlah total 1 adalah sekitar 60% dari ekstrak kasar.Oleh karena itu, kami memutuskan untuk mempelajari secara detail sifat kumamotoamide 1.
Coumamonamide 1 adalah bubuk amorf putih dan spektrometri massa resolusi tinggi (HRESIMS) mengkonfirmasi C6H8N2O2 (Gbr. 1).Fragmen pirol tersubstitusi C2 dari senyawa ini dicirikan oleh δH 6,94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH dalam spektrum 1H NMR: 4.5 Hz , H-5) dan δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), dan spektrum 13C NMR menunjukkan adanya empat atom karbon sp2.Keberadaan gugus Amida pada posisi C2 dinilai dengan korelasi HMBC dari proton C-3 ke karbon karbonil Amida pada δC 161.1.Selain itu, puncak NMR 1 H dan 13 C pada δH 4.10 (3H, S) dan δC 68.3 menunjukkan adanya gugus N-metoksi dalam molekul.Meskipun posisi gugus metoksi yang benar belum ditentukan dengan menggunakan analisis spektroskopi seperti spektroskopi perbedaan yang disempurnakan dan singkatan Nuclear Overhauser (NOEDF), N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamida menjadi kandidat senyawa pertama.
Untuk menentukan struktur 1 yang benar, dilakukan sintesis total (Gbr. 2a).Perlakuan 2-aminopyridine 2 yang tersedia secara komersial dengan m-CPBA menghasilkan N-oksida 3 yang sesuai dalam hasil kuantitatif.Setelah 2-aminoazidasi dari 2, reaksi siklokondensasi yang dijelaskan oleh Abramovich dilakukan dalam benzena pada 90°C untuk memperoleh 1-hidroksi-1H-pirol-2-karbonitril 5 yang diinginkan dalam gram.Kecepatan 60% (dua tahap).15,16.Metilasi dan hidrolisis 4 kemudian menghasilkan asam 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksilat (disebut “asam kumotonik”, 6) dengan hasil yang baik (70%, dua langkah).Akhirnya, tengahasi melalui asam klorida zat antara 6 menggunakan amonia berair menghasilkan Kumamoto amide 1 dengan rendemen 98%.Semua data spektral 1 yang disintesis serupa dengan 1 yang diisolasi, sehingga struktur 1 ditentukan;
Sintesis umum dan analisis aktivitas biologis urbenamida dan asam urbenat.(a) Sintesis total Amida Kumamoto.(b) Bibit Arabidopsis Columbia (Col) tipe liar berumur tujuh hari ditanam di piring Murashige dan Skoog (MS) yang mengandung coumamonamide 6 atau coumamonamide 1 pada konsentrasi yang ditunjukkan.Skala bar = 1 cm.
Pertama, kami menilai aktivitas biologis urbenamida dan zat antara untuk kemampuannya memodulasi pertumbuhan tanaman.Kami menambahkan berbagai konsentrasi ursmonamide 1 atau asam ursmonat 6 ke media agar MS dan membiakkan bibit Arabidopsis thaliana pada media ini.Pengujian ini menunjukkan bahwa konsentrasi tinggi (500 μM) dari 6 menghambat pertumbuhan akar (Gbr. 2b).Selanjutnya, kami menghasilkan berbagai turunan dengan mensubstitusi posisi N1 ke 6 dan melakukan studi hubungan struktur-aktivitas pada turunan tersebut (proses sintesis analog dijelaskan dalam Informasi Pendukung (SI)).Bibit Arabidopsis ditanam pada media yang mengandung 50 μM turunan asam ursonik, dan panjang akar diukur.seperti yang ditunjukkan pada gambar.Seperti ditunjukkan pada Gambar 3a, b, dan S1, asam kumamo memiliki panjang rantai alkoksi linier yang berbeda (9, 10, 11, 12, dan 13) atau rantai alkoksi besar (15, 16, dan 17) pada posisi N1.Turunannya menunjukkan penghambatan pertumbuhan akar yang signifikan.Selain itu, kami menemukan bahwa penerapan 200 μM 10, 11, atau 17 menghambat perkecambahan (Gambar 3c dan S2).
Studi tentang hubungan struktur-aktivitas Amida Kumamoto dan senyawa terkait.(a) Struktur dan skema sintesis analog.(b) Kuantifikasi panjang akar bibit berumur 7 hari yang ditanam pada media MS dengan atau tanpa turunan kumamonamida 50 μM.Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan perlakuan palsu (uji t, hal<0,05).n>18. Data ditampilkan sebagai mean ± SD.nt berarti “belum diuji” karena lebih dari 50% benih tidak berkecambah.(c) Kuantifikasi laju perkecambahan benih yang diberi perlakuan diinkubasi selama 7 hari dalam media MS dengan atau tanpa 200 μM coumamonamide dan senyawa terkait.Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan perlakuan palsu (uji chi-square).n=96.
Menariknya, penambahan rantai samping alkil yang lebih panjang dari C9 mengurangi aktivitas penghambatan, menunjukkan bahwa senyawa yang berhubungan dengan asam kumamotoat memerlukan rantai samping dengan ukuran tertentu untuk menunjukkan aktivitas biologisnya.
Karena analisis hubungan struktur-aktivitas menunjukkan bahwa C9 telah dimodifikasi menjadi asam ursonik dan turunan noniloksi asam ursonik (selanjutnya disebut KAND 11) merupakan penghambat pertumbuhan tanaman yang paling efektif, kami melakukan karakterisasi KAND 11 yang lebih rinci. Pengobatan Arabidopsis dengan 50 μM KAND 11 hampir sepenuhnya mencegah perkecambahan, sedangkan konsentrasi KAND 11 yang lebih rendah (40, 30, 20, atau 10 μM) menghambat pertumbuhan akar dengan cara yang bergantung pada dosis (Gbr. 4a, b).Untuk menguji apakah KAND 11 mempengaruhi viabilitas meristem akar, kami memeriksa meristem akar yang diwarnai dengan propidium iodida (PI) dan mengukur ukuran area meristem.Ukuran meristem bibit yang ditanam pada media yang mengandung 25 μM KAND-11 adalah 151,1 ± 32,5 μm, sedangkan ukuran meristem bibit yang ditanam pada media kontrol yang mengandung DMSO adalah 264,7 ± 30,8 μm (Gbr. 4c, d) , yang menunjukkan bahwa KAND-11 memulihkan aktivitas seluler.menyebar.Meristem akar.Konsisten dengan ini, pengobatan KAND 11 mengurangi jumlah sinyal penanda pembelahan sel CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS di meristem akar (Gbr. 4e) 17 .Hasil ini menunjukkan bahwa KAND 11 menghambat pertumbuhan akar dengan mengurangi aktivitas proliferasi sel.
Analisis pengaruh penghambatan turunan asam urbenonat (turunan urbeniloksi) terhadap pertumbuhan.(a) Bibit Col tipe liar berumur 7 hari ditanam di pelat MS dengan konsentrasi KAND 11 yang ditunjukkan. Skala batang = 1 cm.(b) Kuantifikasi panjang akar.Huruf menunjukkan perbedaan nyata (uji Tukey HSD, hal<0,05).n>16. Data ditampilkan sebagai mean ± SD.(c) Mikroskop confocal dari akar Col tipe liar bernoda propidium iodida yang tumbuh pada pelat MS dengan atau tanpa 25 μM KAND 11. Tanda kurung putih menunjukkan meristem akar.Bilah skala = 100 µm.(d) Kuantifikasi ukuran meristem akar (n = 10 hingga 11).Perbedaan statistik ditentukan dengan menggunakan uji-t (hal<0,05).Batangan mewakili ukuran rata-rata meristem.(e) Mikroskopi kontras interferensi diferensial (DIC) dari meristem akar yang mengandung konstruksi CDKB2;1pro: CDKB2;Pewarnaan 1-GUS dan pewarnaan pada bibit berumur 5 hari yang ditanam pada pelat MS dengan atau tanpa uji KAND 25 µM.
Fitotoksisitas KAND 11 diuji lebih lanjut dengan menggunakan tanaman dikotil lainnya, tembakau (Nicotiana tabacum), dan organisme model tanaman darat utama, lumut hati (Marchantia polymorpha).Seperti halnya Arabidopsis, bibit tembakau SR-1 yang ditanam pada media yang mengandung 25 μM KAND 11 menghasilkan akar yang lebih pendek (Gbr. 5a).Selain itu, 40 dari 48 benih berkecambah pada media yang mengandung 200 μM KAND 11, sedangkan 48 benih berkecambah pada media yang diberi perlakuan tiruan, yang menunjukkan bahwa konsentrasi KAND yang lebih tinggi adalah signifikan (p<0,05;chi test -square) menghambat perkecambahan tembakau.(Gbr. 5b).Selain itu, konsentrasi KAND 11 yang menghambat pertumbuhan bakteri pada lumut hati serupa dengan konsentrasi efektif pada Arabidopsis (Gambar 5c).Hasil tersebut menunjukkan bahwa KAND 11 dapat menghambat pertumbuhan berbagai jenis tanaman.Kami kemudian menyelidiki kemungkinan sitotoksisitas senyawa terkait monoamida beruang pada organisme lain, yaitu sel HeLa manusia dan strain Escherichia coli DH5α, yang masing-masing mewakili sel hewan dan bakteri tingkat tinggi.Dalam serangkaian uji proliferasi sel, kami mengamati bahwa coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6, dan KAND 11 tidak mempengaruhi pertumbuhan sel HeLa atau E. coli pada konsentrasi 100 μM (Gbr. 5d, e).
Penghambatan pertumbuhan KAND 11 pada organisme non-Arabidopsis.(a) Bibit tembakau tipe SR-1 liar berumur dua minggu ditanam pada pelat MS yang ditempatkan secara vertikal yang berisi 25 μM KAND 11. (b) Bibit tembakau tipe SR-1 liar berumur dua minggu ditanam pada posisi horizontal Pelat MS berisi 200 μM KAND 11. (c) Tunas lumut hati Tak-1 tipe liar berumur dua minggu yang ditanam di pelat Gamborg B5 dengan konsentrasi KAND 11 yang ditunjukkan. Panah merah menunjukkan spora yang berhenti tumbuh dalam inkubasi dua minggu periode.(d) Uji proliferasi sel sel HeLa.Jumlah sel yang layak diukur pada interval waktu tetap menggunakan alat penghitung sel 8 (Dojindo).Sebagai kontrol, sel HeLa diobati dengan 5 μg/ml actinomycin D (Act D), yang menghambat transkripsi RNA polimerase dan menyebabkan kematian sel.Analisis dilakukan dalam rangkap tiga.(e) Uji proliferasi sel E. coli.Pertumbuhan E. coli dianalisis dengan mengukur OD600.Sebagai kontrol, sel diobati dengan 50 μg/ml ampisilin (Amp), yang menghambat sintesis dinding sel bakteri.Analisis dilakukan dalam rangkap tiga.
Untuk menguraikan mekanisme kerja sitotoksisitas yang disebabkan oleh senyawa terkait uramide, kami menganalisis ulang turunan asam urbenat dengan efek penghambatan sedang.seperti yang ditunjukkan pada gambar.Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2b, 6a, bibit yang ditanam pada cawan agar yang mengandung asam urmotonat 6 konsentrasi tinggi (200 μM) menghasilkan akar yang lebih pendek dan melengkung ke kiri (θ = – 23,7 ± 6,1), sedangkan bibit yang ditanam pada media kontrol, bibit menghasilkan akar hampir lurus (θ = – 3,8 ± 7,1).Pertumbuhan miring yang khas ini diketahui disebabkan oleh disfungsi mikrotubulus kortikal14,18.Konsisten dengan temuan ini, obat destabilisasi mikrotubulus disopyramide dan oryzalin menginduksi kemiringan akar yang serupa pada kondisi pertumbuhan kita (Gambar 2b, 6a).Pada saat yang sama, kami menguji turunan asam urmotonik dan memilih beberapa di antaranya yang, pada konsentrasi tertentu, menginduksi pertumbuhan akar miring.Senyawa 8, 9, dan 15 mengubah arah pertumbuhan akar masing-masing pada 75 μM, 50 μM, dan 40 μM, menunjukkan bahwa senyawa ini dapat secara efektif mengganggu kestabilan mikrotubulus (Gbr. 2b, 6a).Kami juga menguji turunan asam ursolat paling ampuh, KAND 11, pada konsentrasi yang lebih rendah (15 µM) dan menemukan bahwa pengaplikasian KAND 11 menghambat pertumbuhan akar dan arah pertumbuhan akar tidak merata, meskipun cenderung miring ke kiri ( Gambar C3)..Karena konsentrasi obat destabilisasi mikrotubulus yang lebih tinggi terkadang menghambat pertumbuhan tanaman daripada menyebabkan kemiringan akar, kami kemudian menilai kemungkinan bahwa KAND 11 mempengaruhi mikrotubulus dengan mengamati mikrotubulus kortikal dalam sel epidermis akar.Imunohistokimia menggunakan antibodi anti-β-tubulin dalam sel epidermis akar bibit yang diberi 25 μM KAND 11 menunjukkan hilangnya hampir semua mikrotubulus kortikal dalam sel epidermis di zona pemanjangan (Gbr. 6b).Hasil ini menunjukkan bahwa asam kumamotonic dan turunannya bertindak secara langsung atau tidak langsung pada mikrotubulus untuk mengganggu mikrotubulus dan bahwa senyawa ini merupakan penghambat mikrotubulus baru.
Asam ursonik dan turunannya mengubah mikrotubulus kortikal di Arabidopsis thaliana.(a) Sudut kemiringan akar diukur dengan adanya berbagai turunan asam urmotonat pada konsentrasi yang ditunjukkan.Efek dari dua senyawa yang diketahui menghambat mikrotubulus: disopyramide dan oryzalin juga dianalisis.Sisipan menunjukkan standar yang digunakan untuk mengukur sudut pertumbuhan akar.Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan perlakuan palsu (uji t, hal<0,05).n>19. Bilah skala = 1 cm.(b) Mikrotubulus kortikal dalam sel epidermis di zona pemanjangan.Mikrotubulus pada akar Arabidopsis Col tipe liar yang tumbuh pada pelat MS dengan atau tanpa 25 μM KAND 11 divisualisasikan dengan pewarnaan imunohistokimia menggunakan antibodi primer β-tubulin dan antibodi sekunder terkonjugasi Alexa Fluor.Bilah skala = 10 µm.(c) Struktur mitosis mikrotubulus pada meristem akar.Mikrotubulus divisualisasikan menggunakan pewarnaan imunohistokimia.Struktur mitosis, termasuk zona profase, gelendong, dan phragmoplast, dihitung dari gambar confocal.Panah menunjukkan struktur mikrotubulus mitosis.Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan perlakuan palsu (uji t, hal<0,05).n>9. Bilah skala = 50 µm.
Meskipun Ursa memiliki kemampuan untuk mengganggu fungsi mikrotubulus, mekanisme kerjanya diharapkan berbeda dari agen depolimerisasi mikrotubulus pada umumnya.Misalnya, konsentrasi agen depolimerisasi mikrotubulus yang lebih tinggi seperti disopyramide dan oryzalin menginduksi ekspansi sel epidermis secara anisotropik, sedangkan KAND 11 tidak.Selain itu, aplikasi bersama KAND 11 dan disopyramide menghasilkan gabungan respons pertumbuhan akar yang diinduksi disopyramide dan penghambatan pertumbuhan yang diinduksi KAND 11 diamati (Gbr. S4).Kami juga menganalisis respons mutan disopyramide 1-1 (phs1-1) yang hipersensitif terhadap KAND 11. phs1-1 memiliki mutasi titik tubulin kinase non-kanonik dan menghasilkan akar yang lebih pendek ketika diobati dengan disopyramide9,20.Bibit mutan phs1-1 yang ditanam pada media agar yang mengandung KAND 11 memiliki akar yang lebih pendek serupa dengan yang ditanam pada disopiramid (gbr. S5).
Selain itu, kami mengamati struktur mikrotubulus mitosis, seperti zona profase, gelendong, dan phragmoplast, pada meristem akar bibit yang diberi KAND 11. Konsisten dengan pengamatan untuk CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, terjadi penurunan yang signifikan dalam jumlah mikrotubulus mitosis diamati (Gbr. .6c).
Untuk mengkarakterisasi sitotoksisitas KAND 11 pada resolusi subseluler, kami memperlakukan sel suspensi tembakau BY-2 dengan KAND 11 dan mengamati responsnya.Kami pertama-tama menambahkan sel KAND 11 ke BY-2 yang mengekspresikan TagRFP-TUA6, yang memberi label mikrotubulus secara fluoresensi, untuk menilai efek KAND 11 pada mikrotubulus kortikal.Kepadatan mikrotubulus kortikal dinilai menggunakan analisis gambar, yang mengukur persentase piksel sitoskeletal di antara piksel sitoplasma.Hasil pengujian menunjukkan bahwa setelah perlakuan dengan 50 μM atau 100 μM KAND 11 selama 1 jam, kepadatannya menurun secara signifikan masing-masing menjadi 0,94 ± 0,74% atau 0,23 ± 0,28%, sedangkan kepadatan sel yang diobati dengan DMSO adalah sebesar 1,61 ± 0,34 % (Gbr. 7a).Hasil ini konsisten dengan pengamatan di Arabidopsis bahwa pengobatan KAND 11 menginduksi depolimerisasi mikrotubulus kortikal (Gambar 6b).Kami juga memeriksa garis BY-2 dengan filamen aktin berlabel GFP-ABD setelah pengobatan dengan konsentrasi KAND 11 yang sama dan mengamati bahwa pengobatan KAND 11 mengganggu filamen aktin.Pengobatan dengan 50 μM atau 100 μM KAND 11 selama 1 jam secara signifikan mengurangi kepadatan filamen aktin menjadi 1,20 ± 0,62% atau 0,61 ± 0,26%, masing-masing, sedangkan kepadatan dalam sel yang diobati dengan DMSO adalah 1,69 ± 0,51% (Gbr. 2).7b).Hasil ini kontras dengan efek propyzamide, yang tidak mempengaruhi filamen aktin, dan latrunculin B, suatu depolimerisasi aktin yang tidak mempengaruhi mikrotubulus (SI Gambar S6).Selain itu, pengobatan dengan coumamonamide 1, coumamonamide acid 6, atau KAND 11 tidak mempengaruhi mikrotubulus dalam sel HeLa (SI Gambar S7).Dengan demikian, mekanisme kerja KAND 11 diyakini berbeda dengan pengganggu sitoskeleton yang diketahui.Selain itu, pengamatan mikroskopis kami terhadap sel BY-2 yang diobati dengan KAND 11 mengungkapkan permulaan kematian sel selama pengobatan KAND 11 dan menunjukkan bahwa proporsi sel mati berwarna biru Evans tidak meningkat secara signifikan setelah 30 menit pengobatan KAND 11, sedangkan setelah 90 menit pengobatan dengan KAND 50 μM atau 100 μM, jumlah sel mati masing-masing meningkat menjadi 43,7% atau 80,1% (Gbr. 7c).Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa turunan asam ursolat baru KAND 11 adalah penghambat sitoskeletal spesifik tanaman dengan mekanisme aksi yang sebelumnya tidak diketahui.
KAND mempengaruhi mikrotubulus kortikal, filamen aktin, dan kelangsungan hidup sel BY-2 tembakau.(a) Visualisasi mikrotubulus kortikal dalam sel BY-2 dengan adanya TagRFP-TUA6.Sel BY-2 yang diobati dengan KAND 11 (50 μM atau 100 μM) atau DMSO diperiksa dengan mikroskop confocal.Kepadatan mikrotubulus kortikal dihitung dari mikrograf 25 sel independen.Huruf menunjukkan perbedaan nyata (uji Tukey HSD, hal<0,05).Bilah skala = 10 µm.(b) Filamen aktin kortikal dalam sel BY-2 divisualisasikan dengan adanya GFP-ABD2.Sel BY-2 yang diobati dengan KAND 11 (50 μM atau 100 μM) atau DMSO diperiksa dengan mikroskop confocal.Kepadatan filamen aktin kortikal dihitung dari mikrograf 25 sel independen.Huruf menunjukkan perbedaan nyata (uji Tukey HSD, hal<0,05).Bilah skala = 10 µm.(c) Pengamatan sel BY-2 yang mati dengan pewarnaan biru Evans.Sel BY-2 yang diobati dengan KAND 11 (50 μM atau 100 μM) atau DMSO diperiksa dengan mikroskop medan terang.n=3.Bilah skala = 100 µm.
Penemuan dan penerapan produk alam baru telah membawa kemajuan signifikan dalam berbagai aspek kehidupan manusia, termasuk kedokteran dan pertanian.Penelitian sejarah telah dilakukan untuk memperoleh senyawa bermanfaat dari sumber daya alam.Secara khusus, actinomycetes diketahui berguna sebagai antibiotik antiparasit untuk nematoda karena kemampuannya menghasilkan berbagai metabolit sekunder seperti avermectin, senyawa utama dari ivermectin dan bleomycin dan turunannya, yang digunakan sebagai obat sebagai agen antikanker21,22.Demikian pula, berbagai senyawa herbisida telah ditemukan dari actinomycetes, beberapa di antaranya sudah digunakan secara komersial1,23.Oleh karena itu, analisis metabolit actinomycete untuk mengisolasi produk alami dengan aktivitas biologis yang diinginkan dianggap sebagai strategi yang efektif.Dalam penelitian ini, kami menemukan senyawa baru, coumamonamide, dari S. werraensis dan berhasil mensintesisnya.Asam ursonik adalah zat antara sintetik urbenamida dan turunannya.Hal ini dapat menyebabkan akar melengkung yang khas, menunjukkan aktivitas herbisida sedang hingga kuat, dan secara langsung atau tidak langsung merusak mikrotubulus tanaman.Namun, mekanisme kerja asam urmotonik mungkin berbeda dari inhibitor mikrotubulus yang ada, karena KAND 11 juga mengganggu filamen aktin dan menyebabkan kematian sel, menunjukkan mekanisme pengaturan dimana asam urmotonik dan turunannya mempengaruhi berbagai struktur sitoskeletal..
Karakterisasi asam urbenonat yang lebih rinci akan membantu untuk lebih memahami mekanisme kerja asam urbenonat.Secara khusus, tujuan berikutnya adalah untuk mengevaluasi kemampuan asam ursonik untuk mengikat mikrotubulus tereduksi untuk menentukan apakah asam ursonik dan turunannya bekerja langsung pada mikrotubulus dan mendepolimerisasikannya, atau apakah tindakannya mengakibatkan destabilisasi mikrotubulus.Selain itu, jika mikrotubulus bukan merupakan target langsung, mengidentifikasi lokasi kerja dan target molekul asam ursonik pada sel tumbuhan akan membantu lebih memahami sifat senyawa terkait dan kemungkinan cara untuk meningkatkan aktivitas herbisida.Uji bioaktivitas kami mengungkapkan kemampuan sitotoksik unik asam ursonik terhadap pertumbuhan tanaman seperti Arabidopsis thaliana, tembakau, dan lumut hati, sementara sel E. coli maupun HeLa tidak terpengaruh.Sedikit atau tidak adanya toksisitas terhadap sel hewan merupakan keuntungan dari turunan asam ursonik jika dikembangkan sebagai herbisida untuk digunakan di lahan pertanian terbuka.Memang benar, karena mikrotubulus adalah struktur umum pada eukariota, penghambatan selektifnya pada tanaman merupakan persyaratan utama untuk herbisida.Misalnya, propyzamide, suatu zat depolimerisasi mikrotubulus yang langsung berikatan dengan tubulin dan menghambat polimerisasi, digunakan sebagai herbisida karena toksisitasnya yang rendah terhadap sel hewan24.Berbeda dengan disopyramide, benzamida terkait memiliki spesifisitas target yang berbeda.Selain mikrotubulus tanaman, RH-4032 atau benzoxamide juga masing-masing menghambat mikrotubulus sel hewan atau oomycetes, dan zalilamide digunakan sebagai fungisida karena fitotoksisitasnya yang rendah25,26,27.Beruang yang baru ditemukan dan turunannya menunjukkan sitotoksisitas selektif terhadap tanaman, namun perlu dicatat bahwa modifikasi lebih lanjut dapat mengubah spesifisitas targetnya, sehingga berpotensi memberikan turunan tambahan untuk mengendalikan jamur patogen atau oomycetes.
Sifat unik asam urbenonat dan turunannya berguna untuk pengembangannya sebagai herbisida dan digunakan sebagai alat penelitian.Pentingnya sitoskeleton dalam mengendalikan bentuk sel tumbuhan telah diakui secara luas.Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa tanaman telah mengembangkan mekanisme kompleks organisasi mikrotubulus kortikal dengan mengendalikan dinamika mikrotubulus untuk mengontrol morfogenesis dengan benar.Sejumlah besar molekul yang bertanggung jawab atas regulasi aktivitas mikrotubulus telah diidentifikasi, dan penelitian terkait masih berlangsung3,4,28.Pemahaman kita saat ini mengenai dinamika mikrotubulus dalam sel tumbuhan tidak sepenuhnya menjelaskan mekanisme organisasi mikrotubulus kortikal.Misalnya, meskipun disopyramide dan oryzalin dapat mendepolimerisasi mikrotubulus, disopyramide menyebabkan distorsi akar yang parah sedangkan oryzalin memiliki efek yang relatif ringan.Selain itu, mutasi pada tubulin yang menstabilkan mikrotubulus juga menyebabkan dekstrorotasi pada akar, sedangkan paclitaxel yang juga menstabilkan dinamika mikrotubulus tidak.Oleh karena itu, mempelajari dan mengidentifikasi target molekul asam ursolat harus memberikan wawasan baru mengenai regulasi mikrotubulus kortikal tanaman.Demikian pula, perbandingan bahan kimia di masa depan yang efektif dalam mendorong pertumbuhan yang terdistorsi, seperti disopyramide, dan bahan kimia yang kurang efektif, seperti oryzalin atau asam kumamotoric, akan memberikan petunjuk tentang bagaimana terjadinya distorsi pertumbuhan.
Di sisi lain, penataan ulang sitoskeletal terkait pertahanan adalah kemungkinan lain untuk menjelaskan sitotoksisitas asam ursonik.Infeksi suatu patogen atau masuknya elisitor ke dalam sel tanaman terkadang menyebabkan kerusakan sitoskeleton dan kematian sel berikutnya29.Misalnya, cryptoxanthin yang berasal dari oomycete telah dilaporkan mengganggu mikrotubulus dan filamen aktin sebelum kematian sel tembakau, serupa dengan apa yang terjadi pada pengobatan KAND30,31.Kesamaan antara respons pertahanan dan respons seluler yang disebabkan oleh asam ursonik membuat kami berhipotesis bahwa keduanya memicu proses seluler yang umum, meskipun efek asam ursonik yang lebih cepat dan lebih kuat dibandingkan kriptoxantin terbukti.Namun, penelitian menunjukkan bahwa gangguan pada filamen aktin menyebabkan kematian sel secara spontan, yang tidak selalu disertai dengan gangguan mikrotubulus29.Selain itu, masih harus dilihat apakah patogen atau elisitor menyebabkan distorsi pertumbuhan akar, seperti yang terjadi pada turunan asam ursonik.Dengan demikian, pengetahuan molekuler yang menghubungkan respons pertahanan dan sitoskeleton merupakan masalah yang menarik untuk diatasi.Dengan memanfaatkan keberadaan senyawa berbobot molekul rendah yang terkait dengan asam ursonik, serta sejumlah turunannya dengan potensi berbeda-beda, mereka dapat memberikan peluang untuk menargetkan mekanisme seluler yang tidak diketahui.
Secara keseluruhan, penemuan dan penerapan senyawa baru yang memodulasi dinamika mikrotubulus akan memberikan metode yang ampuh untuk mengatasi mekanisme molekuler kompleks yang mendasari penentuan bentuk sel tanaman.Dalam konteks ini, senyawa asam urmotonik yang dikembangkan baru-baru ini, yang mempengaruhi mikrotubulus dan filamen aktin serta menginduksi kematian sel, dapat memberikan peluang untuk menguraikan hubungan antara kontrol mikrotubulus dan mekanisme lainnya.Dengan demikian, analisis kimia dan biologi menggunakan asam urbenonat akan membantu kita memahami mekanisme pengaturan molekuler yang mengontrol sitoskeleton tumbuhan.
Inokulasi S. werraensis MK493-CF1 ke dalam labu Erlenmeyer 500 mL yang berisi 110 mL media benih yang terdiri dari 2% (b/v) galaktosa, 2% (b/v) pasta Essence, 1% (b/v) komposisi Bacto .- kedelai (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (b/v) ekstrak jagung (KOGOSTCH Co., Ltd., Jepang), 0,2% (b/v) (NH4)2SO4 dan 0,2% CaCO3 dalam air deionisasi.(pH 7,4 sebelum sterilisasi).Kultur benih diinkubasi pada rotary shaker (180 rpm) pada suhu 27°C selama 2 hari.Budidaya produksi melalui fermentasi solid state.Kultur benih (7 ml) dipindahkan ke dalam labu K-1 500 ml yang berisi 40 g media produksi yang terdiri dari 15 g jelai yang diperas (MUSO Co., Ltd., Jepang) dan 25 g air deionisasi (pH tidak disesuaikan sebelum sterilisasi).).Fermentasi dilakukan pada suhu 30°C dalam ruangan gelap selama 14 hari.Bahan fermentasi diekstraksi dengan 40 ml/botol EtOH dan disentrifugasi (1500 g, 4°C, 10 menit).Supernatan kultur (60 ml) diekstraksi dengan campuran 10% MeOH/EtOAc.Lapisan organik diuapkan pada tekanan tereduksi untuk mendapatkan residu (59,5 mg), yang dikenai HPLC dengan elusi gradien (0–10 menit: 90%) pada kolom fase terbalik (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × panjang 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 menit: 90% H2O/CH3CN hingga 70% H2O/CH3CN (gradien), 35–45 menit: 90% H2O/EtOH, 45–155 menit: 90% H2O /EtOH hingga 100% EtOH (gradien (gradien), 155–200 menit: 100% EtOH) pada laju aliran 1,5 ml/menit, kumamonamida (1, 36,0 mg) diisolasi sebagai bubuk amorf putih.
Kumamotoamida(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t , J = 3,8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ nilai terhitung: 141.0659, nilai terukur: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Benih Columbia (Col-0) diperoleh dari Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) dengan izin untuk penggunaan penelitian.Benih Col-0 diperbanyak dan dipelihara dalam kondisi laboratorium kami dan digunakan sebagai tanaman Arabidopsis tipe liar.Benih Arabidopsis disterilkan permukaannya dan dikultur dalam medium Murashige dan Skoog berkekuatan setengah yang mengandung 2% sukrosa (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (b/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical ).) dan agar 1,5% (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, pada 23 °C dan cahaya konstan.Benih mutan phs1-1 disediakan oleh T. Hashimoto (Institut Sains dan Teknologi Nara).
Benih strain SR-1 disediakan oleh T. Hashimoto (Institut Sains dan Teknologi Nara) dan digunakan sebagai tanaman tembakau liar.Benih tembakau disterilkan permukaannya dan direndam dalam air steril selama tiga malam untuk meningkatkan perkecambahan, kemudian ditempatkan dalam larutan setengah kekuatan yang mengandung sukrosa 2%, 0,05% (b/v) MES, dan 0,8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.dan media Skoog) dengan pH 5,7 dan diinkubasi pada suhu 23°C di bawah cahaya konstan.
Strain Tak-1 disediakan oleh T. Kohchi (Universitas Kyoto) dan digunakan sebagai unit percobaan standar untuk studi lumut hati.Gemma diperoleh dari tanaman budidaya yang telah disterilkan kemudian disepuh pada medium Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) yang mengandung sukrosa 1% dan gellan gum 0,3% dan diinkubasi pada suhu 23°C di bawah cahaya terus menerus.
Sel Tembakau BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) disediakan oleh S. Hasezawa (Universitas Tokyo).Sel BY-2 diencerkan 95 kali lipat dalam medium Linsmeier dan Skoog yang dimodifikasi dan ditambah setiap minggu dengan asam 2,4-diklorofenoksiasetat (32).Suspensi sel dicampur pada pengocok putar dengan kecepatan 130 rpm pada suhu 27°C dalam gelap.Cuci sel dengan volume media segar 10 kali lipat dan suspensikan kembali dalam media yang sama.Garis sel transgenik BY-2 yang secara stabil mengekspresikan penanda mikrotubulus TagRFP-TUA6 atau penanda filamen aktin GFP-ABD2 di bawah promotor virus mosaik kembang kol 35S dihasilkan seperti yang dijelaskan33,34,35.Garis sel ini dapat dipertahankan dan disinkronisasikan menggunakan prosedur serupa dengan yang digunakan untuk garis sel BY-2 asli.
Sel HeLa dikultur dalam medium Dulbecco yang dimodifikasi Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) yang dilengkapi dengan 10% serum janin sapi, 1,2 U/ml penisilin, dan 1,2 μg/ml streptomisin dalam inkubator 37°C dengan 5% CO2.
Semua percobaan yang dijelaskan dalam naskah ini dilakukan sesuai dengan peraturan dan pedoman keamanan hayati Jepang.
Senyawa dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) sebagai larutan stok dan diencerkan dalam media MS untuk Arabidopsis dan tembakau atau media Gamborg B5 untuk lumut hati.Untuk uji penghambatan pertumbuhan akar, lebih dari 10 benih per cawan disemai pada media agar yang mengandung senyawa terindikasi atau DMSO.Benih diinkubasi dalam ruang pertumbuhan selama 7 hari.Bibit difoto dan diukur panjang akarnya.Untuk uji perkecambahan Arabidopsis, 48 biji per piring disemai pada media agar yang mengandung senyawa 200 μM atau DMSO.Benih Arabidopsis ditanam dalam ruang tumbuh dan dihitung jumlah bibit yang berkecambah pada umur 7 hari setelah perkecambahan (dag).Untuk uji perkecambahan tembakau, 24 biji per piring disemai pada media agar yang mengandung 200 μM KAND atau DMSO.Benih tembakau ditanam dalam ruang pertumbuhan dan jumlah bibit yang berkecambah dihitung setelah 14 hari.Untuk uji penghambatan pertumbuhan lumut hati, 9 embrio dari masing-masing cawan disepuh pada media agar yang mengandung konsentrasi KAND atau DMSO yang ditunjukkan dan diinkubasi dalam ruang pertumbuhan selama 14 hari.
Gunakan bibit yang diwarnai dengan 5 mg/ml propidium iodida (PI) untuk memvisualisasikan susunan meristem akar.Sinyal PI diamati dengan mikroskop fluoresensi menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
Pewarnaan histokimia akar dengan β-glucuronidase (GUS) dilakukan sesuai dengan protokol yang dijelaskan oleh Malami dan Benfey36.Bibit difiksasi dalam aseton 90% semalaman, diwarnai dengan 0,5 mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-indolyl-β-d-glukuronat dalam buffer GUS selama 1 jam dan ditempatkan dalam larutan kloraldehida terhidrasi.(8 g kloral hidrat, 2 ml air dan 1 ml gliserol) dan diamati dengan mikroskop kontras interferensi diferensial menggunakan mikroskop Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Sudut akar diukur pada bibit berumur 7 hari yang ditanam pada piring yang ditempatkan secara vertikal.Ukur sudut akar dari arah vektor gravitasi seperti dijelaskan pada langkah 6.
Susunan mikrotubulus kortikal diamati seperti yang dijelaskan, dengan sedikit modifikasi pada protokol (37).Antibodi anti-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) dan IgG anti-tikus terkonjugasi Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) digunakan sebagai antibodi primer dan sekunder pada pengenceran 1:1000 dan 1:100, masing-masing.Gambar fluoresensi diperoleh menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).Dapatkan gambar Z-stack dan buat proyeksi intensitas maksimum sesuai dengan instruksi pabrik.
Uji proliferasi sel HeLa dilakukan menggunakan Cell Counting Kit 8 (Dojindo) sesuai dengan instruksi pabrik.
Pertumbuhan E. coli DH5α dianalisis dengan mengukur kepadatan sel dalam kultur menggunakan spektrofotometer pada 600 nm (OD600).
Organisasi sitoskeletal dalam sel BY-2 transgenik diamati menggunakan mikroskop fluoresensi yang dilengkapi dengan perangkat pemindaian confocal CSU-X1 (Yokogawa) dan kamera sCMOS (Zyla, Andor Technology).Kepadatan sitoskeletal dinilai dengan analisis gambar, yang mengukur persentase piksel sitoskeletal di antara piksel sitoplasma dalam gambar confocal menggunakan perangkat lunak ImageJ seperti yang dijelaskan38,39.
Untuk mendeteksi kematian sel dalam sel BY-2, sebagian suspensi sel diinkubasi dengan Evans biru 0,05% selama 10 menit pada suhu kamar.Pewarnaan biru Evans selektif pada sel mati bergantung pada ekstrusi pewarna dari sel hidup oleh membran plasma utuh40.Sel-sel yang diwarnai diamati menggunakan mikroskop medan terang (BX53, Olympus).
Sel HeLa ditanam dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10% FBS dalam inkubator yang dilembabkan pada suhu 37°C dan 5% CO2.Sel diperlakukan dengan 100 μM KAND 11, asam kumamonamic 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), atau 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) selama 6 jam pada suhu 37°C.Sel difiksasi dengan MetOH selama 10 menit dan kemudian dengan asetat selama 5 menit pada suhu kamar.Sel tetap diinkubasi dengan antibodi primer β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) yang diencerkan dalam 0,5% BSA/PBS selama 2 jam, dicuci 3 kali dengan TBST, dan kemudian diinkubasi dengan antibodi kambing Alexa Fluor.488 1 jam.– IgG Tikus (Thermo Fisher Scientific: A11001) dan 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) diencerkan dalam 0,5% BSA/PBS.Setelah dicuci dengan TBST tiga kali, sel-sel yang ternoda diamati pada mikroskop terbalik Nikon Eclipse Ti-E.Gambar diambil dengan kamera CCD Hamamatsu ORCA-R2 yang didinginkan menggunakan perangkat lunak MetaMorph (Perangkat Molekuler).
Waktu posting: 17 Juni 2024