Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi peramban yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk hasil terbaik, kami sarankan Anda menggunakan versi peramban yang lebih baru (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami menampilkan situs tanpa gaya atau JavaScript.
Penemuan dan pemanfaatan produk alami yang bermanfaat dapat membantu meningkatkan kehidupan manusia. Senyawa penghambat pertumbuhan tanaman banyak digunakan sebagai herbisida untuk mengendalikan gulma. Karena kebutuhan untuk menggunakan berbagai jenis herbisida, diperlukan identifikasi senyawa dengan mekanisme kerja baru. Dalam penelitian ini, kami menemukan senyawa N-alkoksipirrol baru, kumamonamida, dari Streptomyces werraensis MK493-CF1 dan menetapkan proses sintesis lengkapnya. Melalui uji aktivitas biologis, kami menemukan bahwa asam urs-monoamida merupakan zat perantara sintesis urs-monoamida dan merupakan senyawa potensial.penghambat pertumbuhan tanamanSelain itu, kami telah mengembangkan berbagai turunan asam urbenonik, termasuk turunan urbeniloksi (UDA), yang memiliki aktivitas herbisida tinggi tanpa memengaruhi pertumbuhan sel HeLa secara negatif. Kami juga menemukan bahwa turunan asam urmotonik mengganggu mikrotubulus tanaman; selain itu, KAND memengaruhi filamen aktin dan menginduksi kematian sel; efek multifaset ini berbeda dari efek penghambat mikrotubulus yang dikenal dan menunjukkan mekanisme kerja baru untuk asam ursonik, yang merupakan keuntungan penting dalam pengembangan herbisida baru.
Penemuan dan penerapan praktis produk alami yang bermanfaat dan turunannya merupakan cara untuk meningkatkan kualitas hidup manusia. Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikroorganisme, tumbuhan, dan serangga telah menghasilkan kemajuan besar dalam bidang kedokteran dan pertanian. Banyak antibiotik dan obat anti-leukemia telah dikembangkan dari produk alami. Selain itu, berbagai jenispestisidaFungisida dan herbisida diekstrak dari produk alami ini untuk digunakan dalam pertanian. Secara khusus, herbisida pengendali gulma merupakan alat penting untuk meningkatkan hasil panen dalam pertanian modern, dan berbagai jenis senyawa telah digunakan secara komersial. Beberapa proses seluler pada tumbuhan, seperti fotosintesis, metabolisme asam amino, sintesis dinding sel, regulasi mitosis, pensinyalan fitohormon, atau sintesis protein, dianggap sebagai target khas herbisida. Senyawa yang menghambat fungsi mikrotubulus adalah kelas herbisida umum yang memengaruhi pertumbuhan tanaman dengan memengaruhi regulasi mitosis².
Mikrotubulus merupakan komponen sitoskeleton dan sangat terkonservasi dalam sel eukariotik. Heterodimer tubulin terdiri dari α-tubulin dan β-tubulin yang membentuk protofilamen mikrotubulus linier, dengan 13 protofilamen membentuk struktur silindris. Mikrotubulus memainkan berbagai peran dalam sel tumbuhan, termasuk menentukan bentuk sel, pembelahan sel, dan transportasi intraseluler3,4. Sel tumbuhan mengandung mikrotubulus di bawah membran plasma interfase, dan mikrotubulus kortikal ini diduga mengontrol organisasi mikrofibril selulosa melalui pengaturan kompleks selulosa sintase4,5. Mikrotubulus kortikal sel epidermis akar, yang terdapat di zona pemanjangan cepat ujung akar, terletak lateral, dan mikrofiber selulosa mengikuti mikrotubulus ini dan membatasi arah ekspansi sel, sehingga mendorong pemanjangan sel anisotropik. Oleh karena itu, fungsi mikrotubulus sangat berkaitan dengan morfologi tumbuhan. Substitusi asam amino pada gen yang mengkode tubulin menyebabkan kemiringan susunan mikrotubulus kortikal dan pertumbuhan sisi kiri atau kanan pada Arabidopsis 6,7. Demikian pula, mutasi pada protein terkait mikrotubulus yang mengatur dinamika mikrotubulus juga dapat menyebabkan pertumbuhan akar yang terdistorsi8,9,10,11,12,13. Selain itu, perlakuan dengan herbisida pengganggu mikrotubulus seperti disopyramide, juga dikenal sebagai pretilachlor, juga menyebabkan pertumbuhan akar miring ke sisi kiri14. Data ini menunjukkan bahwa pengaturan fungsi mikrotubulus yang tepat sangat penting untuk menentukan arah pertumbuhan tanaman.
Berbagai jenis penghambat mikrotubulus telah ditemukan, dan obat-obatan ini telah memberikan kontribusi signifikan terhadap penelitian sitoskeleton, serta pertanian dan kedokteran². Secara khusus, oryzalin, senyawa dinitroanilin, disopiramida, senyawa terkait benzamida, dan analognya dapat menghambat fungsi mikrotubulus dan dengan demikian menghambat pertumbuhan tanaman. Oleh karena itu, senyawa-senyawa ini banyak digunakan sebagai herbisida. Namun, karena mikrotubulus merupakan komponen penting dari sel tumbuhan dan hewan, sebagian besar penghambat mikrotubulus bersifat sitotoksik terhadap kedua jenis sel tersebut. Oleh karena itu, meskipun kegunaannya sebagai herbisida telah diakui, hanya sejumlah kecil agen antimikrotubulus yang digunakan untuk tujuan praktis.
Streptomyces adalah genus dari famili Streptomyces, yang meliputi bakteri aerobik, gram-positif, dan berfilamen, dan dikenal luas karena kemampuannya menghasilkan berbagai macam metabolit sekunder. Oleh karena itu, Streptomyces dianggap sebagai salah satu sumber terpenting produk alami aktif biologis baru. Dalam penelitian ini, kami menemukan senyawa baru yang disebut coumamonamide, yang diisolasi dari Streptomyces werraensis MK493-CF1 dan S. werraensis ISP 5486. Dengan menggunakan analisis spektral dan analisis spektral lengkap, struktur coumamonamide dikarakterisasi dan kerangka N-alkoxypyrrole yang unik ditentukan. Asam ursmonat, suatu zat perantara sintetik dari ursmonoamide dan turunannya, ditemukan dapat menghambat pertumbuhan dan perkecambahan tanaman model populer Arabidopsis thaliana. Dalam studi hubungan struktur-aktivitas, kami menemukan bahwa senyawa dengan C9 yang dimodifikasi menjadi asam ursonik, yang disebut turunan noniloksi asam ursonik (KAND), secara signifikan meningkatkan efek penghambatan pada pertumbuhan dan perkecambahan. Yang menarik, penghambat pertumbuhan tanaman yang baru ditemukan ini juga memengaruhi pertumbuhan tembakau dan lumut hati dan tidak bersifat sitotoksik terhadap bakteri atau sel HeLa. Lebih jauh lagi, beberapa turunan asam urmotonik menginduksi fenotipe akar yang terdistorsi, yang menyiratkan bahwa turunan ini secara langsung atau tidak langsung memengaruhi mikrotubulus. Sesuai dengan gagasan ini, pengamatan kami terhadap mikrotubulus yang diberi label secara imunohistokimia atau dengan protein fluoresen menunjukkan bahwa perlakuan KAND mendepolimerisasi mikrotubulus. Selain itu, perlakuan dengan turunan asam kumamotonik mengganggu mikrofilamen aktin. Dengan demikian, kami telah menemukan penghambat pertumbuhan tanaman baru yang mekanisme kerjanya yang unik melibatkan penghancuran sitoskeleton.
Strain MK493-CF1 diisolasi dari tanah di Shinagawa-ku, Tokyo. Strain MK493-CF1 membentuk miselium stroma yang bercabang dengan baik. Urutan parsial gen RNA ribosom 16S (1422 bp) telah ditentukan. Strain ini sangat mirip dengan S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: strain tipikal, 99,93%). Berdasarkan hasil ini, ditentukan bahwa strain ini berkerabat dekat dengan strain tipe S. werraensis. Oleh karena itu, kami secara sementara menamai strain ini S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T juga menghasilkan senyawa bioaktif yang sama. Karena sedikit penelitian awal tentang perolehan produk alami dari mikroorganisme ini, penelitian kimia lebih lanjut dilakukan. Setelah kultivasi S. werraensis MK493-CF1 pada media jelai dengan fermentasi padat pada suhu 30°C selama 14 hari, media diekstraksi dengan EtOH 50%. 60 ml sampel dikeringkan untuk mendapatkan 59,5 mg ekstrak kasar. Ekstrak kasar tersebut dianalisis dengan HPLC fase terbalik untuk menghasilkan N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamida (1, disebut kumamonamida, 36,0 mg). Jumlah total 1 kira-kira 60% dari ekstrak kasar. Oleh karena itu, kami memutuskan untuk mempelajari secara detail sifat-sifat kumamotoamida 1.
Kumamonamida 1 adalah bubuk amorf berwarna putih dan spektrometri massa resolusi tinggi (HRESIMS) mengkonfirmasi C6H8N2O2 (Gambar 1). Fragmen pirol tersubstitusi C2 dari senyawa ini ditandai dengan δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH dalam spektrum 1H NMR: 4,5 Hz, H-5) dan δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), dan spektrum 13C NMR menunjukkan adanya empat atom karbon sp2. Keberadaan gugus amida pada posisi C2 dinilai dengan korelasi HMBC dari proton C-3 ke karbonil amida pada δC 161,1. Selain itu, puncak NMR 1H dan 13C pada δH 4,10 (3H, S) dan δC 68,3 menunjukkan adanya gugus N-metoksi dalam molekul. Meskipun posisi yang tepat dari gugus metoksi belum ditentukan menggunakan analisis spektroskopi seperti spektroskopi perbedaan yang ditingkatkan dan singkatan Overhauser nuklir (NOEDF), N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamida menjadi senyawa kandidat pertama.
Untuk menentukan struktur yang benar dari 1, sintesis total dilakukan (Gambar 2a). Perlakuan 2-aminopiridin 2 yang tersedia secara komersial dengan m-CPBA menghasilkan N-oksida 3 yang sesuai dengan hasil kuantitatif. Setelah 2-aminoazidasi 2, reaksi siklokondensasi yang dijelaskan oleh Abramovich dilakukan dalam benzena pada suhu 90°C untuk mendapatkan 1-hidroksi-1H-pirol-2-karbonitril 5 yang diinginkan dalam gram. Kecepatan 60% (dua tahap). 15,16. Metilasi dan hidrolisis 4 kemudian menghasilkan asam 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksilat (disebut "asam kumotonat", 6) dengan hasil yang baik (70%, dua langkah). Akhirnya, amidasi melalui perantara klorida asam 6 menggunakan amonia berair menghasilkan amida Kumamoto 1 dengan hasil 98%. Semua data spektral dari senyawa 1 yang disintesis serupa dengan senyawa 1 yang diisolasi, sehingga struktur senyawa 1 dapat ditentukan;
Sintesis umum dan analisis aktivitas biologis urbenamida dan asam urbenat. (a) Sintesis total amida Kumamoto. (b) Bibit Arabidopsis Columbia (Col) tipe liar berumur tujuh hari ditanam pada lempeng Murashige dan Skoog (MS) yang mengandung kumamonamida 6 atau kumamonamida 1 pada konsentrasi yang ditunjukkan. Skala bar = 1 cm.
Pertama, kami menilai aktivitas biologis urbenamida dan intermediatnya untuk kemampuan mereka dalam memodulasi pertumbuhan tanaman. Kami menambahkan berbagai konsentrasi ursmonamida 1 atau asam ursmonat 6 ke media agar MS dan membudidayakan bibit Arabidopsis thaliana pada media ini. Pengujian ini menunjukkan bahwa konsentrasi tinggi (500 μM) dari 6 menghambat pertumbuhan akar (Gambar 2b). Selanjutnya, kami menghasilkan berbagai turunan dengan mensubstitusi posisi N1 dari 6 dan melakukan studi hubungan struktur-aktivitas pada turunan tersebut (proses sintesis analog dijelaskan dalam Informasi Pendukung (SI)). Bibit Arabidopsis ditanam pada media yang mengandung 50 μM turunan asam ursonik, dan panjang akar diukur, seperti yang ditunjukkan pada gambar. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3a, b, dan S1, asam kumamo memiliki panjang rantai alkoksi linier yang berbeda (9, 10, 11, 12, dan 13) atau rantai alkoksi besar (15, 16, dan 17) pada posisi N1. Turunan tersebut menunjukkan penghambatan pertumbuhan akar yang signifikan. Selain itu, kami menemukan bahwa aplikasi 200 μM 10, 11, atau 17 menghambat perkecambahan (Gambar 3c dan S2).
Studi tentang hubungan struktur-aktivitas amida Kumamoto dan senyawa terkait. (a) Struktur dan skema sintesis analog. (b) Kuantifikasi panjang akar bibit berumur 7 hari yang ditanam pada media MS dengan atau tanpa turunan kumamonamida 50 μM. Tanda bintang menunjukkan perbedaan signifikan dengan perlakuan kontrol (uji t, p < 0,05).< 0,05). n>18. Data disajikan sebagai mean ± SD. nt berarti “tidak diuji” karena lebih dari 50% biji tidak berkecambah. (c) Kuantifikasi tingkat perkecambahan biji yang diberi perlakuan dan diinkubasi selama 7 hari dalam media MS dengan atau tanpa 200 μM coumamonamide dan senyawa terkait. Tanda bintang menunjukkan perbedaan signifikan dengan perlakuan kontrol (uji chi-square). n=96.
Menariknya, penambahan rantai samping alkil yang lebih panjang dari C9 mengurangi aktivitas penghambatan, menunjukkan bahwa senyawa yang terkait dengan asam kumamotoat membutuhkan rantai samping dengan ukuran tertentu untuk menunjukkan aktivitas biologisnya.
Karena analisis hubungan struktur-aktivitas menunjukkan bahwa C9 dimodifikasi menjadi asam ursonik dan turunan noniloksi dari asam ursonik (selanjutnya disebut sebagai KAND 11) adalah penghambat pertumbuhan tanaman yang paling efektif, kami melakukan karakterisasi KAND 11 yang lebih rinci. Perlakuan Arabidopsis dengan 50 μM KAND 11 hampir sepenuhnya mencegah perkecambahan, sedangkan konsentrasi yang lebih rendah (40, 30, 20, atau 10 μM) KAND 11 menghambat pertumbuhan akar secara bergantung pada dosis (Gambar 4a, b). Untuk menguji apakah KAND 11 memengaruhi viabilitas meristem akar, kami memeriksa meristem akar yang diwarnai dengan propidium iodida (PI) dan mengukur ukuran area meristem. Ukuran meristem bibit yang ditanam pada media yang mengandung 25 μM KAND-11 adalah 151,1 ± 32,5 μm, sedangkan ukuran meristem bibit yang ditanam pada media kontrol yang mengandung DMSO adalah 264,7 ± 30,8 μm (Gambar 4c, d), yang menunjukkan bahwa KAND-11 mengembalikan aktivitas seluler. Penyebaran. Meristem akar. Konsisten dengan hal ini, perlakuan KAND-11 mengurangi jumlah sinyal penanda pembelahan sel CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS di meristem akar (Gambar 4e) 17. Hasil ini menunjukkan bahwa KAND-11 menghambat pertumbuhan akar dengan mengurangi aktivitas proliferasi sel.
Analisis efek penghambatan turunan asam urbenonik (turunan urbeniloksi) terhadap pertumbuhan. (a) Bibit Col tipe liar berumur 7 hari yang ditanam pada lempeng MS dengan konsentrasi KAND 11 yang ditunjukkan. Skala bar = 1 cm. (b) Kuantifikasi panjang akar. Huruf menunjukkan perbedaan signifikan (uji Tukey HSD, p < 0,05).< 0,05). n>16. Data disajikan sebagai mean ± SD. (c) Mikroskopi konfokal akar Col tipe liar yang diwarnai propidium iodida yang ditumbuhkan pada lempeng MS dengan atau tanpa 25 μM KAND 11. Tanda kurung putih menunjukkan meristem akar. Skala bar = 100 µm. (d) Kuantifikasi ukuran meristem akar (n = 10 hingga 11). Perbedaan statistik ditentukan menggunakan uji t (p< 0,05). Batang-batang tersebut mewakili ukuran meristem rata-rata. (e) Mikroskopi kontras interferensi diferensial (DIC) dari meristem akar yang mengandung konstruksi CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS diwarnai dan diwarnai pada bibit berumur 5 hari yang ditanam pada lempeng MS dengan atau tanpa uji KAND 25 µM.
Toksisitas fitokimia KAND 11 selanjutnya diuji menggunakan tanaman dikotil lain, tembakau (Nicotiana tabacum), dan organisme model tanaman darat utama, lumut hati (Marchantia polymorpha). Seperti halnya pada Arabidopsis, bibit tembakau SR-1 yang ditanam pada media yang mengandung 25 μM KAND 11 menghasilkan akar yang lebih pendek (Gambar 5a). Selain itu, 40 dari 48 biji berkecambah pada cawan petri yang mengandung 200 μM KAND 11, sedangkan semua 48 biji berkecambah pada media yang diberi perlakuan kontrol, menunjukkan bahwa konsentrasi KAND yang lebih tinggi berpengaruh signifikan (p < 0,05).< 0,05; uji chi-kuadrat) menghambat perkecambahan tembakau. (Gambar 5b). Selain itu, konsentrasi KAND 11 yang menghambat pertumbuhan bakteri pada lumut hati mirip dengan konsentrasi efektif pada Arabidopsis (Gambar 5c). Hasil ini menunjukkan bahwa KAND 11 dapat menghambat pertumbuhan berbagai tanaman. Kami kemudian menyelidiki kemungkinan sitotoksisitas senyawa terkait monoamida beruang pada organisme lain, yaitu sel HeLa manusia dan strain Escherichia coli DH5α, sebagai perwakilan sel hewan tingkat tinggi dan sel bakteri. Dalam serangkaian uji proliferasi sel, kami mengamati bahwa kumamonamida 1, asam kumamonamidik 6, dan KAND 11 tidak memengaruhi pertumbuhan sel HeLa atau E. coli pada konsentrasi 100 μM (Gambar 5d,e).
Penghambatan pertumbuhan KAND 11 pada organisme non-Arabidopsis. (a) Bibit tembakau SR-1 tipe liar berumur dua minggu ditanam pada cawan MS yang diposisikan vertikal dan mengandung 25 μM KAND 11. (b) Bibit tembakau SR-1 tipe liar berumur dua minggu ditanam pada cawan MS yang diposisikan horizontal dan mengandung 200 μM KAND 11. (c) Tunas lumut hati Tak-1 tipe liar berumur dua minggu ditanam pada cawan Gamborg B5 dengan konsentrasi KAND 11 yang ditunjukkan. Panah merah menunjukkan spora yang berhenti tumbuh dalam periode inkubasi dua minggu. (d) Uji proliferasi sel HeLa. Jumlah sel hidup diukur pada interval waktu tetap menggunakan kit penghitung sel 8 (Dojindo). Sebagai kontrol, sel HeLa diberi perlakuan dengan 5 μg/ml aktinomisin D (Act D), yang menghambat transkripsi RNA polimerase dan menyebabkan kematian sel. Analisis dilakukan dalam rangkap tiga. (e) Uji proliferasi sel E. coli. Pertumbuhan E. coli dianalisis dengan mengukur OD600. Sebagai kontrol, sel diberi perlakuan dengan 50 μg/ml ampisilin (Amp), yang menghambat sintesis dinding sel bakteri. Analisis dilakukan sebanyak tiga kali.
Untuk menguraikan mekanisme kerja sitotoksisitas yang disebabkan oleh senyawa terkait uramide, kami menganalisis ulang turunan asam urbenat dengan efek penghambatan sedang, seperti yang ditunjukkan pada gambar. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2b, 6a, bibit yang ditanam pada cawan agar yang mengandung konsentrasi tinggi (200 μM) asam urmotonat 6 menghasilkan akar yang lebih pendek dan melengkung ke kiri (θ = – 23,7 ± 6,1), sedangkan bibit yang ditanam pada media kontrol menghasilkan akar yang hampir lurus (θ = – 3,8 ± 7,1). Pertumbuhan miring yang khas ini diketahui disebabkan oleh disfungsi mikrotubulus kortikal14,18. Konsisten dengan temuan ini, obat-obatan pendestabilisasi mikrotubulus disopyramide dan oryzalin menginduksi kemiringan akar yang serupa dalam kondisi pertumbuhan kami (Gambar 2b, 6a). Pada saat yang sama, kami menguji turunan asam urmotonat dan memilih beberapa di antaranya yang, pada konsentrasi tertentu, menginduksi pertumbuhan akar miring. Senyawa 8, 9, dan 15 mengubah arah pertumbuhan akar masing-masing pada konsentrasi 75 μM, 50 μM, dan 40 μM, menunjukkan bahwa senyawa-senyawa ini dapat secara efektif mendestabilisasi mikrotubulus (Gambar 2b, 6a). Kami juga menguji turunan asam ursolat yang paling ampuh, KAND 11, pada konsentrasi yang lebih rendah (15 µM) dan menemukan bahwa aplikasi KAND 11 menghambat pertumbuhan akar dan arah pertumbuhan akar tidak merata, meskipun cenderung miring ke kiri (Gambar C3). Karena konsentrasi obat pendestabil mikrotubulus yang lebih tinggi terkadang menghambat pertumbuhan tanaman daripada menyebabkan kemiringan akar, kami kemudian menilai kemungkinan bahwa KAND 11 memengaruhi mikrotubulus dengan mengamati mikrotubulus kortikal pada sel epidermis akar. Imunohistokimia menggunakan antibodi anti-β-tubulin pada sel epidermis akar bibit yang diberi perlakuan dengan 25 μM KAND 11 menunjukkan hilangnya hampir semua mikrotubulus kortikal pada sel epidermis di zona pemanjangan (Gambar 6b). Hasil ini menunjukkan bahwa asam kumamotonat dan turunannya bekerja secara langsung atau tidak langsung pada mikrotubulus untuk mengganggunya dan bahwa senyawa-senyawa ini merupakan inhibitor mikrotubulus baru.
Asam ursonik dan turunannya mengubah mikrotubulus kortikal pada Arabidopsis thaliana. (a) Sudut kemiringan akar yang diukur dengan adanya berbagai turunan asam urmotonik pada konsentrasi yang ditunjukkan. Efek dari dua senyawa yang diketahui menghambat mikrotubulus: disopiramida dan oryzalin juga dianalisis. Sisipan menunjukkan standar yang digunakan untuk mengukur sudut pertumbuhan akar. Tanda bintang menunjukkan perbedaan signifikan dengan perlakuan kontrol (uji t, p < 0,05).< 0,05). n>19. Skala = 1 cm. (b) Mikrotubulus kortikal pada sel epidermis di zona elongasi. Mikrotubulus pada akar Arabidopsis Col tipe liar yang ditumbuhkan pada lempeng MS dengan atau tanpa 25 μM KAND 11 divisualisasikan dengan pewarnaan imunohistokimia menggunakan antibodi primer β-tubulin dan antibodi sekunder terkonjugasi Alexa Fluor. Skala = 10 µm. (c) Struktur mitosis mikrotubulus di meristem akar. Mikrotubulus divisualisasikan menggunakan pewarnaan imunohistokimia. Struktur mitosis, termasuk zona profase, spindel, dan fragmoplas, dihitung dari gambar konfokal. Panah menunjukkan struktur mikrotubulus mitosis. Tanda bintang menunjukkan perbedaan signifikan dengan perlakuan sham (uji t, p < 0,05).< 0,05). n>9. Skala = 50 µm.
Meskipun Ursa memiliki kemampuan untuk mengganggu fungsi mikrotubulus, mekanisme kerjanya diperkirakan berbeda dari agen depolimerisasi mikrotubulus pada umumnya. Misalnya, konsentrasi agen depolimerisasi mikrotubulus yang lebih tinggi seperti disopiramida dan oryzalin menginduksi ekspansi anisotropik sel epidermis, sedangkan KAND 11 tidak. Selain itu, aplikasi bersama KAND 11 dan disopiramida menghasilkan respons pertumbuhan akar yang diinduksi disopiramida dan penghambatan pertumbuhan yang diinduksi KAND 11 (Gambar S4). Kami juga menganalisis respons mutan hipersensitif disopiramida 1-1 (phs1-1) terhadap KAND 11. phs1-1 memiliki mutasi titik kinase tubulin non-kanonik dan menghasilkan akar yang lebih pendek ketika diberi perlakuan dengan disopiramida9,20. Bibit mutan phs1-1 yang ditanam pada media agar yang mengandung KAND 11 memiliki akar yang lebih pendek mirip dengan yang ditanam pada disopiramida (Gambar S5).
Selain itu, kami mengamati struktur mikrotubulus mitosis, seperti zona profase, spindel, dan fragmoplas, di meristem akar bibit yang diberi perlakuan KAND 11. Konsisten dengan pengamatan untuk CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, penurunan signifikan jumlah mikrotubulus mitosis diamati (Gambar 6c).
Untuk mengkarakterisasi sitotoksisitas KAND 11 pada resolusi subseluler, kami mengobati sel suspensi tembakau BY-2 dengan KAND 11 dan mengamati responsnya. Pertama, kami menambahkan KAND 11 ke sel BY-2 yang mengekspresikan TagRFP-TUA6, yang memberi label fluoresen pada mikrotubulus, untuk menilai efek KAND 11 pada mikrotubulus kortikal. Kepadatan mikrotubulus kortikal dinilai menggunakan analisis citra, yang mengukur persentase piksel sitoskeletal di antara piksel sitoplasma. Hasil pengujian menunjukkan bahwa setelah pengobatan dengan 50 μM atau 100 μM KAND 11 selama 1 jam, kepadatan menurun secara signifikan menjadi 0,94 ± 0,74% atau 0,23 ± 0,28%, masing-masing, sedangkan kepadatan sel yang diobati dengan DMSO mencapai 1,61 ± 0,34% (Gambar 7a). Hasil ini konsisten dengan pengamatan pada Arabidopsis bahwa perlakuan KAND 11 menginduksi depolimerisasi mikrotubulus kortikal (Gambar 6b). Kami juga memeriksa galur BY-2 dengan filamen aktin berlabel GFP-ABD setelah perlakuan dengan konsentrasi KAND 11 yang sama dan mengamati bahwa perlakuan KAND 11 mengganggu filamen aktin. Perlakuan dengan 50 μM atau 100 μM KAND 11 selama 1 jam secara signifikan mengurangi kepadatan filamen aktin menjadi 1,20 ± 0,62% atau 0,61 ± 0,26%, masing-masing, sedangkan kepadatan pada sel yang diberi perlakuan DMSO adalah 1,69 ± 0,51% (Gambar 2). 7b). Hasil ini kontras dengan efek propyzamide, yang tidak memengaruhi filamen aktin, dan latrunculin B, depolimerisasi aktin yang tidak memengaruhi mikrotubulus (Gambar S6 pada Informasi Tambahan). Selain itu, pengobatan dengan coumamonamide 1, asam coumamonamide 6, atau KAND 11 tidak memengaruhi mikrotubulus pada sel HeLa (Gambar S7 pada Informasi Tambahan). Dengan demikian, mekanisme kerja KAND 11 diyakini berbeda dari mekanisme kerja pengganggu sitoskeleton yang telah diketahui. Selain itu, pengamatan mikroskopis kami terhadap sel BY-2 yang diobati dengan KAND 11 mengungkapkan timbulnya kematian sel selama pengobatan KAND 11 dan menunjukkan bahwa proporsi sel mati yang diwarnai Evans blue tidak meningkat secara signifikan setelah 30 menit pengobatan KAND 11, sedangkan setelah 90 menit pengobatan dengan 50 μM atau 100 μM KAND, jumlah sel mati meningkat menjadi 43,7% atau 80,1%, masing-masing (Gambar 7c). Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa turunan asam ursolat baru KAND 11 adalah penghambat sitoskeleton spesifik tumbuhan dengan mekanisme kerja yang sebelumnya tidak diketahui.
KAND memengaruhi mikrotubulus kortikal, filamen aktin, dan viabilitas sel tembakau BY-2. (a) Visualisasi mikrotubulus kortikal pada sel BY-2 dengan adanya TagRFP-TUA6. Sel BY-2 yang diberi perlakuan KAND 11 (50 μM atau 100 μM) atau DMSO diperiksa dengan mikroskop konfokal. Kepadatan mikrotubulus kortikal dihitung dari mikrograf 25 sel independen. Huruf menunjukkan perbedaan signifikan (uji Tukey HSD, p < 0,05).< 0,05). Skala bar = 10 µm. (b) Filamen aktin kortikal pada sel BY-2 divisualisasikan dengan adanya GFP-ABD2. Sel BY-2 yang diberi perlakuan KAND 11 (50 μM atau 100 μM) atau DMSO diperiksa dengan mikroskopi konfokal. Kepadatan filamen aktin kortikal dihitung dari mikrograf 25 sel independen. Huruf menunjukkan perbedaan signifikan (uji Tukey HSD, p < 0,05).< 0,05). Skala bar = 10 µm. (c) Pengamatan sel BY-2 yang mati dengan pewarnaan Evans blue. Sel BY-2 yang diberi perlakuan KAND 11 (50 μM atau 100 μM) atau DMSO diperiksa dengan mikroskop medan terang. n=3. Skala bar = 100 µm.
Penemuan dan penerapan produk alami baru telah menghasilkan kemajuan signifikan dalam berbagai aspek kehidupan manusia, termasuk kedokteran dan pertanian. Penelitian historis telah dilakukan untuk memperoleh senyawa bermanfaat dari sumber daya alam. Secara khusus, aktinomisetes dikenal bermanfaat sebagai antibiotik antiparasit untuk nematoda karena kemampuannya menghasilkan berbagai metabolit sekunder seperti avermectin, senyawa utama ivermectin dan bleomycin serta turunannya, yang digunakan secara medis sebagai agen antikanker21,22. Demikian pula, berbagai senyawa herbisida telah ditemukan dari aktinomisetes, beberapa di antaranya sudah digunakan secara komersial1,23. Oleh karena itu, analisis metabolit aktinomisetes untuk mengisolasi produk alami dengan aktivitas biologis yang diinginkan dianggap sebagai strategi yang efektif. Dalam penelitian ini, kami menemukan senyawa baru, coumamonamide, dari S. werraensis dan berhasil mensintesisnya. Asam ursonik adalah perantara sintetik urbenamide dan turunannya. Senyawa ini dapat menyebabkan penggulungan akar yang khas, menunjukkan aktivitas herbisida sedang hingga kuat, dan secara langsung atau tidak langsung merusak mikrotubulus tanaman. Namun, mekanisme kerja asam urmotonat mungkin berbeda dari penghambat mikrotubulus yang ada, karena KAND 11 juga mengganggu filamen aktin dan menyebabkan kematian sel, menunjukkan mekanisme pengaturan di mana asam urmotonat dan turunannya memengaruhi berbagai struktur sitoskeleton.
Karakterisasi asam urbenonik yang lebih rinci akan membantu untuk lebih memahami mekanisme kerja asam urbenonik. Secara khusus, tujuan selanjutnya adalah untuk mengevaluasi kemampuan asam ursonik untuk berikatan dengan mikrotubulus tereduksi guna menentukan apakah asam ursonik dan turunannya bekerja langsung pada mikrotubulus dan mendepolimerisasinya, atau apakah aksinya mengakibatkan destabilisasi mikrotubulus. Selain itu, jika mikrotubulus bukan target langsung, mengidentifikasi tempat kerja dan target molekuler asam ursonik pada sel tumbuhan akan membantu lebih memahami sifat-sifat senyawa terkait dan kemungkinan cara untuk meningkatkan aktivitas herbisida. Uji bioaktivitas kami mengungkapkan kemampuan sitotoksik unik asam ursonik pada pertumbuhan tanaman seperti Arabidopsis thaliana, tembakau, dan lumut hati, sementara sel E. coli maupun sel HeLa tidak terpengaruh. Toksisitas yang rendah atau tidak ada sama sekali terhadap sel hewan merupakan keuntungan dari turunan asam ursonik jika dikembangkan sebagai herbisida untuk digunakan di lahan pertanian terbuka. Memang, karena mikrotubulus merupakan struktur umum pada eukariota, penghambatan selektifnya pada tumbuhan merupakan persyaratan utama untuk herbisida. Misalnya, propyzamide, agen depolimerisasi mikrotubulus yang secara langsung mengikat tubulin dan menghambat polimerisasi, digunakan sebagai herbisida karena toksisitasnya yang rendah terhadap sel hewan24. Berbeda dengan disopyramide, benzamida terkait memiliki spesifisitas target yang berbeda. Selain mikrotubulus tumbuhan, RH-4032 atau benzoxamide juga menghambat mikrotubulus sel hewan atau oomycetes, dan zalilamide digunakan sebagai fungisida karena fitotoksisitasnya yang rendah25,26,27. Senyawa bear yang baru ditemukan dan turunannya menunjukkan sitotoksisitas selektif terhadap tumbuhan, tetapi perlu dicatat bahwa modifikasi lebih lanjut dapat mengubah spesifisitas targetnya, berpotensi menyediakan turunan tambahan untuk pengendalian jamur patogen atau oomycetes.
Sifat unik asam urbenonik dan turunannya bermanfaat untuk pengembangannya sebagai herbisida dan penggunaannya sebagai alat penelitian. Pentingnya sitoskeleton dalam mengendalikan bentuk sel tumbuhan telah diakui secara luas. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa tumbuhan telah mengembangkan mekanisme kompleks pengorganisasian mikrotubulus kortikal dengan mengendalikan dinamika mikrotubulus untuk mengendalikan morfogenesis dengan tepat. Sejumlah besar molekul yang bertanggung jawab atas pengaturan aktivitas mikrotubulus telah diidentifikasi, dan penelitian terkait masih terus berlangsung3,4,28. Pemahaman kita saat ini tentang dinamika mikrotubulus dalam sel tumbuhan tidak sepenuhnya menjelaskan mekanisme pengorganisasian mikrotubulus kortikal. Misalnya, meskipun disopiramida dan oryzalin dapat mendepolimerisasi mikrotubulus, disopiramida menyebabkan distorsi akar yang parah sedangkan oryzalin memiliki efek yang relatif ringan. Selain itu, mutasi pada tubulin, yang menstabilkan mikrotubulus, juga menyebabkan dekstrorotasi pada akar, sedangkan paclitaxel, yang juga menstabilkan dinamika mikrotubulus, tidak. Oleh karena itu, mempelajari dan mengidentifikasi target molekuler asam ursolat seharusnya memberikan wawasan baru tentang regulasi mikrotubulus kortikal tanaman. Demikian pula, perbandingan di masa mendatang antara bahan kimia yang efektif dalam mendorong pertumbuhan yang menyimpang, seperti disopiramida, dan bahan kimia yang kurang efektif, seperti oryzalin atau asam kumamotorik, akan memberikan petunjuk tentang bagaimana pertumbuhan yang menyimpang terjadi.
Di sisi lain, penataan ulang sitoskeleton yang terkait dengan pertahanan merupakan kemungkinan lain untuk menjelaskan sitotoksisitas asam ursonik. Infeksi patogen atau pengenalan elisitor ke dalam sel tanaman terkadang menyebabkan kerusakan sitoskeleton dan kematian sel selanjutnya29. Misalnya, kriptoxantin yang berasal dari oomycete dilaporkan mengganggu mikrotubulus dan filamen aktin sebelum kematian sel tembakau, mirip dengan apa yang terjadi dengan perlakuan KAND30,31. Kesamaan antara respons pertahanan dan respons seluler yang diinduksi oleh asam ursonik membuat kami berhipotesis bahwa keduanya memicu proses seluler yang umum, meskipun efek asam ursonik yang lebih cepat dan lebih kuat daripada kriptoxantin terlihat jelas. Namun, penelitian telah menunjukkan bahwa gangguan filamen aktin mendorong kematian sel spontan, yang tidak selalu disertai dengan gangguan mikrotubulus29. Selain itu, masih perlu dilihat apakah patogen atau elisitor menyebabkan pertumbuhan akar yang terdistorsi, seperti yang dilakukan oleh turunan asam ursonik. Oleh karena itu, pengetahuan molekuler yang menghubungkan respons pertahanan dan sitoskeleton merupakan masalah menarik yang perlu ditangani. Dengan memanfaatkan keberadaan senyawa berbobot molekul rendah yang terkait dengan asam ursonik, serta berbagai turunannya dengan potensi yang berbeda-beda, senyawa-senyawa ini dapat memberikan peluang untuk menargetkan mekanisme seluler yang belum diketahui.
Secara keseluruhan, penemuan dan penerapan senyawa baru yang memodulasi dinamika mikrotubulus akan memberikan metode yang ampuh untuk mengatasi mekanisme molekuler kompleks yang mendasari penentuan bentuk sel tumbuhan. Dalam konteks ini, senyawa asam urmotonat yang baru dikembangkan, yang memengaruhi mikrotubulus dan filamen aktin serta menginduksi kematian sel, dapat memberikan peluang untuk menguraikan hubungan antara kontrol mikrotubulus dan mekanisme lainnya. Dengan demikian, analisis kimia dan biologi menggunakan asam urbenonik akan membantu kita memahami mekanisme pengaturan molekuler yang mengendalikan sitoskeleton tumbuhan.
Inokulasi S. werraensis MK493-CF1 ke dalam labu Erlenmeyer 500 mL yang dilengkapi sekat, berisi 110 mL media bibit yang terdiri dari 2% (b/v) galaktosa, 2% (b/v) pasta Essence, 1% (b/v) komposisi Bacto - kedelai (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (b/v) ekstrak jagung (KOGOSTCH Co., Ltd., Jepang), 0,2% (b/v) (NH4)2SO4 dan 0,2% CaCO3 dalam air deionisasi (pH 7,4 sebelum sterilisasi). Kultur bibit diinkubasi pada pengocok putar (180 rpm) pada suhu 27°C selama 2 hari. Budidaya produksi melalui fermentasi padat. Kultur bibit (7 ml) dipindahkan ke dalam labu K-1 500 ml yang berisi 40 g media produksi yang terdiri dari 15 g jelai yang telah dipres (MUSO Co., Ltd., Jepang) dan 25 g air deionisasi (pH tidak disesuaikan sebelum sterilisasi). Fermentasi dilakukan pada suhu 30°C dalam kondisi gelap selama 14 hari. Bahan fermentasi diekstraksi dengan 40 ml/botol EtOH dan disentrifugasi (1500 g, 4°C, 10 menit). Supernatan kultur (60 ml) diekstraksi dengan campuran 10% MeOH/EtOAc. Lapisan organik diuapkan di bawah tekanan rendah untuk mendapatkan residu (59,5 mg), yang kemudian dianalisis dengan HPLC menggunakan elusi gradien (0–10 menit: 90%) pada kolom fase terbalik (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × panjang 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 menit: 90% H2O/CH3CN hingga 70% H2O/CH3CN (gradien), 35–45 menit: 90% H2O/EtOH, 45–155 menit: 90% H2O/EtOH hingga 100% EtOH (gradien), 155–200 menit: 100% EtOH) dengan laju alir 1,5 ml/menit, dan kumamonamida (1, 36,0 mg) diisolasi sebagai bubuk amorf berwarna putih.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ nilai terhitung: 141,0659, nilai terukur: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Benih Columbia (Col-0) diperoleh dari Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) dengan izin untuk penggunaan penelitian. Benih Col-0 diperbanyak dan dipelihara dalam kondisi laboratorium kami dan digunakan sebagai tanaman Arabidopsis tipe liar. Benih Arabidopsis disterilkan permukaannya dan dikultur dalam media Murashige dan Skoog setengah kekuatan yang mengandung 2% sukrosa (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) asam 2-(4-morfolino)etanesulfonat (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical), dan 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, pada suhu 23 °C dan cahaya konstan. Benih mutan phs1-1 disediakan oleh T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Benih strain SR-1 disediakan oleh T. Hashimoto (Institut Sains dan Teknologi Nara) dan digunakan sebagai tanaman tembakau tipe liar. Benih tembakau disterilkan permukaannya dan direndam dalam air steril selama tiga malam untuk mendorong perkecambahan, kemudian ditempatkan dalam larutan setengah konsentrasi yang mengandung 2% sukrosa, 0,05% (w/v) MES, dan 0,8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. dan media Skoog) dengan pH 5,7 dan diinkubasi pada suhu 23°C di bawah cahaya konstan.
Strain Tak-1 disediakan oleh T. Kohchi (Universitas Kyoto) dan digunakan sebagai unit eksperimental standar untuk penelitian lumut hati. Gemma diperoleh dari tanaman budidaya yang telah disterilkan, kemudian ditanam pada media Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) yang mengandung 1% sukrosa dan 0,3% gellan gum, dan diinkubasi pada suhu 23°C di bawah cahaya terus menerus.
Sel tembakau BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) disediakan oleh S. Hasezawa (Universitas Tokyo). Sel BY-2 diencerkan 95 kali lipat dalam medium Linsmeier dan Skoog yang dimodifikasi dan ditambahkan setiap minggu dengan asam 2,4-diklorofenoksiasetat 32. Suspensi sel dicampur pada pengocok putar dengan kecepatan 130 rpm pada suhu 27°C dalam kondisi gelap. Cuci sel dengan 10 kali volume medium segar dan suspensikan kembali dalam medium yang sama. Garis sel transgenik BY-2 yang secara stabil mengekspresikan penanda mikrotubulus TagRFP-TUA6 atau penanda filamen aktin GFP-ABD2 di bawah promotor virus mosaik kembang kol 35S dihasilkan seperti yang dijelaskan33,34,35. Garis sel ini dapat dipelihara dan disinkronkan menggunakan prosedur yang mirip dengan yang digunakan untuk garis sel BY-2 asli.
Sel HeLa dikultur dalam medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) yang dilengkapi dengan 10% serum janin sapi, 1,2 U/ml penisilin, dan 1,2 μg/ml streptomisin dalam inkubator 37°C dengan 5% CO2.
Semua percobaan yang dijelaskan dalam manuskrip ini dilakukan sesuai dengan peraturan dan pedoman keamanan hayati Jepang.
Senyawa-senyawa tersebut dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) sebagai larutan stok dan diencerkan dalam medium MS untuk Arabidopsis dan tembakau atau medium Gamborg B5 untuk lumut hati. Untuk uji penghambatan pertumbuhan akar, lebih dari 10 biji per cawan ditabur pada medium agar yang mengandung senyawa yang disebutkan atau DMSO. Biji diinkubasi dalam ruang pertumbuhan selama 7 hari. Bibit difoto dan panjang akarnya diukur. Untuk uji perkecambahan Arabidopsis, 48 biji per cawan ditabur pada medium agar yang mengandung senyawa 200 μM atau DMSO. Biji Arabidopsis ditanam dalam ruang pertumbuhan dan jumlah bibit yang berkecambah dihitung 7 hari setelah perkecambahan (dag). Untuk uji perkecambahan tembakau, 24 biji per cawan ditabur pada medium agar yang mengandung KAND 200 μM atau DMSO. Biji tembakau ditanam dalam ruang pertumbuhan dan jumlah bibit yang berkecambah dihitung setelah 14 hari. Untuk uji penghambatan pertumbuhan lumut hati, 9 embrio dari setiap cawan petri ditanam pada media agar yang mengandung konsentrasi KAND atau DMSO yang telah ditentukan dan diinkubasi dalam ruang pertumbuhan selama 14 hari.
Gunakan bibit yang diwarnai dengan propidium iodida (PI) 5 mg/ml untuk memvisualisasikan organisasi meristem akar. Sinyal PI diamati dengan mikroskop fluoresensi menggunakan mikroskop pemindaian laser konfokal TCS SPE (Leica Microsystems).
Pewarnaan histokimia akar dengan β-glukuronidase (GUS) dilakukan sesuai dengan protokol yang dijelaskan oleh Malami dan Benfey36. Bibit difiksasi dalam 90% aseton semalaman, diwarnai dengan 0,5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid dalam buffer GUS selama 1 jam dan ditempatkan dalam larutan kloraldehida terhidrasi (8 g kloral hidrat, 2 ml air dan 1 ml gliserol) dan diamati dengan mikroskop kontras interferensi diferensial menggunakan mikroskop Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Sudut akar diukur pada bibit berumur 7 hari yang ditanam pada cawan petri yang ditempatkan secara vertikal. Ukur sudut akar dari arah vektor gravitasi seperti yang dijelaskan pada langkah 6.
Susunan mikrotubulus kortikal diamati seperti yang dijelaskan, dengan sedikit modifikasi pada protokol 37. Antibodi anti-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) dan anti-mouse IgG terkonjugasi Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) digunakan sebagai antibodi primer dan sekunder pada pengenceran 1:1000 dan 1:100, masing-masing. Gambar fluoresensi diperoleh menggunakan mikroskop pemindaian laser konfokal TCS SPE (Leica Microsystems). Ambil gambar tumpukan Z dan buat proyeksi intensitas maksimum sesuai dengan instruksi pabrikan.
Pengujian proliferasi sel HeLa dilakukan menggunakan Cell Counting Kit 8 (Dojindo) sesuai dengan petunjuk pabrik.
Pertumbuhan E. coli DH5α dianalisis dengan mengukur kepadatan sel dalam kultur menggunakan spektrofotometer pada 600 nm (OD600).
Organisasi sitoskeleton pada sel BY-2 transgenik diamati menggunakan mikroskop fluoresensi yang dilengkapi dengan perangkat pemindai konfokal CSU-X1 (Yokogawa) dan kamera sCMOS (Zyla, Andor Technology). Kepadatan sitoskeleton dinilai dengan analisis gambar, yang mengkuantifikasi persentase piksel sitoskeleton di antara piksel sitoplasma dalam gambar konfokal menggunakan perangkat lunak ImageJ seperti yang dijelaskan38,39.
Untuk mendeteksi kematian sel pada sel BY-2, sebagian suspensi sel diinkubasi dengan 0,05% Evans blue selama 10 menit pada suhu ruang. Pewarnaan selektif Evans blue pada sel mati bergantung pada ekstrusi zat warna dari sel hidup oleh membran plasma yang utuh40. Sel yang diwarnai diamati menggunakan mikroskop medan terang (BX53, Olympus).
Sel HeLa ditumbuhkan dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10% FBS dalam inkubator lembap pada suhu 37°C dan 5% CO2. Sel diberi perlakuan dengan 100 μM KAND 11, asam kumamonamat 6, kumamonamida 1, 100 ng/ml kolsemid (Gibco), atau 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) selama 6 jam pada suhu 37°C. Sel difiksasi dengan MetOH selama 10 menit dan kemudian dengan asetat selama 5 menit pada suhu kamar. Sel yang telah difiksasi diinkubasi dengan antibodi primer β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) yang diencerkan dalam 0,5% BSA/PBS selama 2 jam, dicuci 3 kali dengan TBST, dan kemudian diinkubasi dengan antibodi kambing Alexa Fluor. 488 1 jam. – IgG tikus (Thermo Fisher Scientific: A11001) dan 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) diencerkan dalam 0,5% BSA/PBS. Setelah dicuci dengan TBST tiga kali, sel yang diwarnai diamati pada mikroskop terbalik Nikon Eclipse Ti-E. Gambar diambil dengan kamera CCD Hamamatsu ORCA-R2 berpendingin menggunakan perangkat lunak MetaMorph (Molecular Devices).
Waktu posting: 17 Juni 2024