Untuk efektifmengendalikan nyamukUntuk mengurangi kejadian penyakit yang mereka bawa, diperlukan alternatif strategis, berkelanjutan, dan ramah lingkungan sebagai pengganti pestisida kimia. Kami mengevaluasi tepung biji dari Brassicaceae tertentu (famili Brassica) sebagai sumber isotiosianat yang berasal dari tumbuhan yang diproduksi melalui hidrolisis enzimatik glukosinolat yang tidak aktif secara biologis untuk digunakan dalam pengendalian Aedes Mesir (L., 1762). Lima jenis tepung biji tanpa lemak (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 dan Thlaspi arvense – tiga jenis utama inaktivasi termal dan degradasi enzimatik Produk kimia Untuk menentukan toksisitas (LC50) alil isotiosianat, benzil isotiosianat dan 4-hidroksibenzilisotiosianat terhadap larva Aedes aegypti pada paparan 24 jam = 0,04 g/120 ml dH2O). Nilai LC50 untuk sawi, sawi putih dan ekor kuda. Tepung biji alfalfa masing-masing memiliki LC50 0,05, 0,08, dan 0,05 dibandingkan dengan alil isotiosianat (LC50 = 19,35 ppm) dan 4-hidroksibenzilisotiosianat (LC50 = 55,41 ppm). Senyawa ini lebih toksik terhadap larva setelah 24 jam perlakuan dibandingkan dengan 0,1 g/120 ml dH2O. Hasil ini konsisten dengan produksi tepung biji alfalfa. Efisiensi ester benzil yang lebih tinggi sesuai dengan nilai LC50 yang dihitung. Penggunaan tepung biji dapat memberikan metode pengendalian nyamuk yang efektif. Efektivitas bubuk biji cruciferous dan komponen kimia utamanya terhadap larva nyamuk menunjukkan bagaimana senyawa alami dalam bubuk biji cruciferous dapat berfungsi sebagai larvasida ramah lingkungan yang menjanjikan untuk pengendalian nyamuk.
Penyakit yang ditularkan melalui vektor yang disebabkan oleh nyamuk Aedes tetap menjadi masalah kesehatan masyarakat global yang besar. Kejadian penyakit yang ditularkan nyamuk menyebar secara geografis1,2,3 dan muncul kembali, menyebabkan wabah penyakit parah4,5,6,7. Penyebaran penyakit di antara manusia dan hewan (misalnya, chikungunya, demam berdarah, demam Rift Valley, demam kuning, dan virus Zika) belum pernah terjadi sebelumnya. Demam berdarah saja menempatkan sekitar 3,6 miliar orang berisiko terinfeksi di daerah tropis, dengan perkiraan 390 juta infeksi terjadi setiap tahun, yang mengakibatkan 6.100–24.300 kematian per tahun8. Kemunculan kembali dan wabah virus Zika di Amerika Selatan telah menarik perhatian dunia karena kerusakan otak yang ditimbulkannya pada anak-anak yang lahir dari wanita yang terinfeksi2. Kremer dkk. 3 memperkirakan bahwa jangkauan geografis nyamuk Aedes akan terus meluas dan pada tahun 2050, setengah dari populasi dunia akan berisiko terinfeksi oleh arbovirus yang ditularkan nyamuk.
Kecuali vaksin yang baru dikembangkan untuk melawan demam berdarah dan demam kuning, vaksin untuk sebagian besar penyakit yang ditularkan nyamuk belum dikembangkan9,10,11. Vaksin masih tersedia dalam jumlah terbatas dan hanya digunakan dalam uji klinis. Pengendalian vektor nyamuk menggunakan insektisida sintetis telah menjadi strategi utama untuk mengendalikan penyebaran penyakit yang ditularkan nyamuk12,13. Meskipun pestisida sintetis efektif dalam membunuh nyamuk, penggunaan pestisida sintetis yang berkelanjutan berdampak negatif pada organisme non-target dan mencemari lingkungan14,15,16. Yang lebih mengkhawatirkan adalah tren peningkatan resistensi nyamuk terhadap insektisida kimia17,18,19. Masalah-masalah yang terkait dengan pestisida ini telah mempercepat pencarian alternatif yang efektif dan ramah lingkungan untuk mengendalikan vektor penyakit.
Berbagai tanaman telah dikembangkan sebagai sumber fitopestisida untuk pengendalian hama20,21. Zat tanaman umumnya ramah lingkungan karena dapat terurai secara hayati dan memiliki toksisitas rendah atau dapat diabaikan terhadap organisme non-target seperti mamalia, ikan, dan amfibi20,22. Preparasi herbal diketahui menghasilkan berbagai senyawa bioaktif dengan mekanisme kerja yang berbeda untuk secara efektif mengendalikan berbagai tahap kehidupan nyamuk23,24,25,26. Senyawa yang berasal dari tanaman seperti minyak atsiri dan bahan aktif tanaman lainnya telah menarik perhatian dan membuka jalan bagi alat inovatif untuk mengendalikan vektor nyamuk. Minyak atsiri, monoterpen, dan sesquiterpen bertindak sebagai penolak, penghambat makan, dan ovicida27,28,29,30,31,32,33. Banyak minyak nabati menyebabkan kematian larva, pupa, dan nyamuk dewasa34,35,36, yang memengaruhi sistem saraf, pernapasan, endokrin, dan sistem penting lainnya pada serangga37.
Penelitian terbaru telah memberikan wawasan tentang potensi penggunaan tanaman sawi dan bijinya sebagai sumber senyawa bioaktif. Tepung biji sawi telah diuji sebagai biofumigan38,39,40,41 dan digunakan sebagai bahan perbaikan tanah untuk menekan gulma42,43,44 dan mengendalikan patogen tanaman yang ditularkan melalui tanah45,46,47,48,49,50, nutrisi tanaman, nematoda 41,51, 52, 53, 54 dan hama 55, 56, 57, 58, 59, 60. Aktivitas fungisida dari bubuk biji ini dikaitkan dengan senyawa pelindung tanaman yang disebut isotiosianat38,42,60. Pada tanaman, senyawa pelindung ini disimpan dalam sel tanaman dalam bentuk glukosinolat yang tidak bioaktif. Namun, ketika tanaman rusak akibat serangan serangga atau infeksi patogen, glukosinolat dihidrolisis oleh myrosinase menjadi isotiosianat bioaktif55,61. Isotiosianat adalah senyawa volatil yang diketahui memiliki aktivitas antimikroba dan insektisida spektrum luas, dan struktur, aktivitas biologis, serta kandungannya sangat bervariasi di antara spesies Brassicaceae42,59,62,63.
Meskipun isotiosianat yang berasal dari tepung biji sawi diketahui memiliki aktivitas insektisida, data tentang aktivitas biologis terhadap vektor arthropoda yang penting secara medis masih kurang. Studi kami meneliti aktivitas larvasida dari empat bubuk biji sawi yang telah dihilangkan lemaknya terhadap larva nyamuk Aedes aegypti. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengevaluasi potensi penggunaannya sebagai biopestisida ramah lingkungan untuk pengendalian nyamuk. Tiga komponen kimia utama dari tepung biji sawi, yaitu alil isotiosianat (AITC), benzil isotiosianat (BITC), dan 4-hidroksibenzilisotiosianat (4-HBITC) juga diuji untuk menguji aktivitas biologis komponen kimia ini pada larva nyamuk. Ini adalah laporan pertama yang mengevaluasi efektivitas empat bubuk biji sawi dan komponen kimia utamanya terhadap larva nyamuk.
Koloni laboratorium Aedes aegypti (galur Rockefeller) dipelihara pada suhu 26°C, kelembaban relatif (RH) 70%, dan periode terang-gelap 10:14 jam (L:D). Nyamuk betina yang telah kawin ditempatkan dalam sangkar plastik (tinggi 11 cm dan diameter 9,5 cm) dan diberi makan melalui sistem pemberian makan botol menggunakan darah sapi sitrat (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, USA). Pemberian makan darah dilakukan seperti biasa menggunakan wadah makan multi-kaca membran (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, USA) yang terhubung ke tabung penangas air bersirkulasi (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, USA) dengan kontrol suhu 37 °C. Rentangkan lapisan Parafilm M di bagian bawah setiap ruang makan kaca (luas 154 mm2). Setiap wadah makan kemudian ditempatkan di atas kisi-kisi penutup sangkar yang berisi nyamuk betina yang sedang kawin. Sekitar 350–400 μl darah sapi ditambahkan ke corong pengumpan kaca menggunakan pipet Pasteur (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) dan cacing dewasa dibiarkan menetes setidaknya selama satu jam. Cacing betina yang hamil kemudian diberi larutan sukrosa 10% dan dibiarkan bertelur di atas kertas saring lembap yang dilapisi di dalam cangkir soufflé ultra-jernih individual (ukuran 1,25 fl oz, Dart Container Corp., Mason, MI, USA). Masukkan kertas saring yang berisi telur ke dalam kantong tertutup (SC Johnsons, Racine, WI) dan simpan pada suhu 26°C. Telur ditetaskan dan sekitar 200–250 larva dibesarkan dalam nampan plastik yang berisi campuran pakan kelinci (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, USA) dan bubuk hati (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, USA). dan fillet ikan (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Jerman) dengan rasio 2:1:1. Larva instar ketiga akhir digunakan dalam bioassay kami.
Bahan benih tanaman yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari sumber komersial dan pemerintah berikut: Brassica juncea (mustard cokelat-Pacific Gold) dan Brassica juncea (mustard putih-Ida Gold) dari Pacific Northwest Farmers' Cooperative, Negara Bagian Washington, AS; (Garden Cress) dari Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, AS dan Thlaspi arvense (Field Pennycress-Elisabeth) dari USDA-ARS, Peoria, IL, AS; Tidak satu pun benih yang digunakan dalam penelitian ini diberi perlakuan pestisida. Semua bahan benih diproses dan digunakan dalam penelitian ini sesuai dengan peraturan lokal dan nasional serta mematuhi semua peraturan lokal, negara bagian, dan nasional yang relevan. Penelitian ini tidak meneliti varietas tanaman transgenik.
Biji Brassica juncea (PG), Alfalfa (Ls), Mustard putih (IG), dan Thlaspi arvense (DFP) digiling hingga menjadi bubuk halus menggunakan penggiling ultrasentrifugal Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Jerman) yang dilengkapi dengan saringan 0,75 mm dan rotor baja tahan karat, 12 gigi, 10.000 rpm (Tabel 1). Bubuk biji yang telah digiling dipindahkan ke wadah kertas dan dihilangkan lemaknya dengan heksana dalam alat Soxhlet selama 24 jam. Subsampel mustard lapangan yang telah dihilangkan lemaknya dipanaskan pada suhu 100 °C selama 1 jam untuk mendenaturasi myrosinase dan mencegah hidrolisis glukosinolat untuk membentuk isotiosianat yang aktif secara biologis. Bubuk biji ekor kuda yang dipanaskan (DFP-HT) digunakan sebagai kontrol negatif dengan mendenaturasi myrosinase.
Kandungan glukosinolat pada tepung biji yang telah dihilangkan lemaknya ditentukan dalam tiga kali pengulangan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) sesuai dengan protokol yang telah dipublikasikan sebelumnya 64. Secara singkat, 3 mL metanol ditambahkan ke sampel 250 mg bubuk biji yang telah dihilangkan lemaknya. Setiap sampel disonikasi dalam penangas air selama 30 menit dan dibiarkan dalam gelap pada suhu 23°C selama 16 jam. Aliquot 1 mL dari lapisan organik kemudian disaring melalui filter 0,45 μm ke dalam autosampler. Dengan menggunakan sistem HPLC Shimadzu (dua pompa LC 20AD; autosampler SIL 20A; degasser DGU 20As; detektor UV-VIS SPD-20A untuk pemantauan pada 237 nm; dan modul bus komunikasi CBM-20A), kandungan glukosinolat pada tepung biji ditentukan dalam tiga kali pengulangan. Analisis dilakukan menggunakan perangkat lunak Shimadzu LC Solution versi 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, USA). Kolom yang digunakan adalah kolom fase terbalik C18 Inertsil (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, USA). Kondisi fase gerak awal ditetapkan pada 12% metanol/88% 0,01 M tetrabutilamonium hidroksida dalam air (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dengan laju alir 1 mL/min. Setelah penyuntikan 15 μl sampel, kondisi awal dipertahankan selama 20 menit, kemudian rasio pelarut disesuaikan menjadi 100% metanol, dengan total waktu analisis sampel 65 menit. Kurva standar (nM/berbasis mAb) dihasilkan dengan pengenceran serial standar sinapine, glukosinolat, dan myrosin yang baru disiapkan (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) untuk memperkirakan kandungan sulfur dari tepung biji yang telah dihilangkan lemaknya. Konsentrasi glukosinolat dalam sampel diuji pada HPLC Agilent 1100 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) menggunakan OpenLAB CDS ChemStation versi (C.01.07 SR2 [255]) yang dilengkapi dengan kolom yang sama dan menggunakan metode yang telah dijelaskan sebelumnya. Konsentrasi glukosinolat ditentukan; dapat dibandingkan antar sistem HPLC.
Alil isotiosianat (94%, stabil) dan benzil isotiosianat (98%) dibeli dari Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). 4-Hidroksibenzilisotiosianat dibeli dari ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Ketika dihidrolisis secara enzimatik oleh mirosinase, glukosinolat, glukosinolat, dan glukosinolat masing-masing membentuk alil isotiosianat, benzil isotiosianat, dan 4-hidroksibenzilisotiosianat.
Bioassay laboratorium dilakukan menurut metode Muturi dkk. 32 dengan modifikasi. Lima pakan biji rendah lemak digunakan dalam penelitian ini: DFP, DFP-HT, IG, PG, dan Ls. Dua puluh larva ditempatkan dalam gelas kimia tiga arah sekali pakai 400 mL (VWR International, LLC, Radnor, PA, USA) yang berisi 120 mL air deionisasi (dH2O). Tujuh konsentrasi tepung biji diuji untuk toksisitas larva nyamuk: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 dan 0,12 g tepung biji/120 ml dH2O untuk tepung biji DFP, DFP-HT, IG, dan PG. Bioassay pendahuluan menunjukkan bahwa tepung biji Ls yang telah dihilangkan lemaknya lebih beracun daripada empat tepung biji lainnya yang diuji. Oleh karena itu, kami menyesuaikan tujuh konsentrasi perlakuan tepung biji Ls menjadi konsentrasi berikut: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065, dan 0,075 g/120 mL dH2O.
Kelompok kontrol tanpa perlakuan (dH20, tanpa suplemen tepung biji) disertakan untuk menilai mortalitas serangga normal dalam kondisi pengujian. Bioassay toksikologi untuk setiap tepung biji mencakup tiga gelas kimia tiga lereng (20 larva instar ketiga akhir per gelas kimia), dengan total 108 vial. Wadah yang diberi perlakuan disimpan pada suhu ruangan (20-21°C) dan mortalitas larva dicatat selama 24 dan 72 jam paparan terus menerus terhadap konsentrasi perlakuan. Jika tubuh dan anggota tubuh nyamuk tidak bergerak ketika ditusuk atau disentuh dengan spatula baja tahan karat tipis, larva nyamuk dianggap mati. Larva yang mati biasanya tetap tidak bergerak dalam posisi dorsal atau ventral di dasar wadah atau di permukaan air. Percobaan diulang tiga kali pada hari yang berbeda menggunakan kelompok larva yang berbeda, dengan total 180 larva yang terpapar setiap konsentrasi perlakuan.
Toksisitas AITC, BITC, dan 4-HBITC terhadap larva nyamuk dinilai menggunakan prosedur bioassay yang sama tetapi dengan perlakuan yang berbeda. Siapkan larutan stok 100.000 ppm untuk setiap bahan kimia dengan menambahkan 100 µL bahan kimia ke dalam 900 µL etanol absolut dalam tabung sentrifugasi 2 mL dan kocok selama 30 detik untuk mencampur secara menyeluruh. Konsentrasi perlakuan ditentukan berdasarkan bioassay pendahuluan kami, yang menemukan bahwa BITC jauh lebih toksik daripada AITC dan 4-HBITC. Untuk menentukan toksisitas, digunakan 5 konsentrasi BITC (1, 3, 6, 9 dan 12 ppm), 7 konsentrasi AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 dan 35 ppm) dan 6 konsentrasi 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 dan 35 ppm). 30, 45, 60, 75 dan 90 ppm). Perlakuan kontrol disuntikkan dengan 108 μL etanol absolut, yang setara dengan volume maksimum perlakuan kimia. Bioassay diulangi seperti di atas, dengan mengekspos total 180 larva per konsentrasi perlakuan. Mortalitas larva dicatat untuk setiap konsentrasi AITC, BITC, dan 4-HBITC setelah 24 jam paparan terus menerus.
Analisis probit dari 65 data mortalitas terkait dosis dilakukan menggunakan perangkat lunak Polo (Polo Plus, LeOra Software, versi 1.0) untuk menghitung konsentrasi letal 50% (LC50), konsentrasi letal 90% (LC90), kemiringan, koefisien dosis letal, dan konsentrasi letal 95% berdasarkan interval kepercayaan untuk rasio dosis letal untuk konsentrasi yang ditransformasikan logaritma dan kurva dosis-mortalitas. Data mortalitas didasarkan pada data replikasi gabungan dari 180 larva yang terpapar pada setiap konsentrasi perlakuan. Analisis probabilistik dilakukan secara terpisah untuk setiap tepung biji dan setiap komponen kimia. Berdasarkan interval kepercayaan 95% dari rasio dosis letal, toksisitas tepung biji dan konstituen kimia terhadap larva nyamuk dianggap berbeda secara signifikan, sehingga interval kepercayaan yang mengandung nilai 1 tidak berbeda secara signifikan, P = 0,0566.
Hasil HPLC untuk penentuan glukosinolat utama dalam tepung biji tanpa lemak DFP, IG, PG, dan Ls tercantum dalam Tabel 1. Glukosinolat utama dalam tepung biji yang diuji bervariasi kecuali DFP dan PG, yang keduanya mengandung glukosinolat myrosinase. Kandungan myrosinin dalam PG lebih tinggi daripada dalam DFP, masing-masing 33,3 ± 1,5 dan 26,5 ± 0,9 mg/g. Bubuk biji Ls mengandung 36,6 ± 1,2 mg/g glukoglikon, sedangkan bubuk biji IG mengandung 38,0 ± 0,5 mg/g sinapin.
Larva nyamuk Ae. Aedes aegypti terbunuh ketika diberi perlakuan dengan tepung biji tanpa lemak, meskipun efektivitas perlakuan bervariasi tergantung pada spesies tanaman. Hanya DFP-NT yang tidak beracun bagi larva nyamuk setelah 24 dan 72 jam paparan (Tabel 2). Toksisitas bubuk biji aktif meningkat seiring dengan peningkatan konsentrasi (Gambar 1A, B). Toksisitas tepung biji terhadap larva nyamuk bervariasi secara signifikan berdasarkan 95% CI dari rasio dosis letal nilai LC50 pada penilaian 24 jam dan 72 jam (Tabel 3). Setelah 24 jam, efek toksik tepung biji Ls lebih besar daripada perlakuan tepung biji lainnya, dengan aktivitas tertinggi dan toksisitas maksimum terhadap larva (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Larva kurang sensitif terhadap DFP pada 24 jam dibandingkan dengan perlakuan bubuk biji IG, Ls, dan PG, dengan nilai LC50 masing-masing 0,115, 0,04, dan 0,08 g/120 ml dH2O, yang secara statistik lebih tinggi daripada nilai LC50 0,211 g/120 ml dH2O (Tabel 3). Nilai LC90 DFP, IG, PG, dan Ls masing-masing adalah 0,376, 0,275, 0,137, dan 0,074 g/120 ml dH2O (Tabel 2). Konsentrasi tertinggi DPP adalah 0,12 g/120 ml dH2O. Setelah 24 jam penilaian, rata-rata mortalitas larva hanya 12%, sedangkan rata-rata mortalitas larva IG dan PG masing-masing mencapai 51% dan 82%. Setelah 24 jam evaluasi, rata-rata mortalitas larva untuk perlakuan tepung biji Ls dengan konsentrasi tertinggi (0,075 g/120 ml dH2O) adalah 99% (Gambar 1A).
Kurva mortalitas diperkirakan dari respons dosis (Probit) larva Ae. Egyptian (larva instar ke-3) terhadap konsentrasi tepung biji 24 jam (A) dan 72 jam (B) setelah perlakuan. Garis putus-putus mewakili LC50 dari perlakuan tepung biji. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Thlaspi arvense yang diinaktivasi panas, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
Pada evaluasi 72 jam, nilai LC50 dari tepung biji DFP, IG, dan PG masing-masing adalah 0,111, 0,085, dan 0,051 g/120 ml dH2O. Hampir semua larva yang terpapar tepung biji Ls mati setelah 72 jam terpapar, sehingga data mortalitas tidak konsisten dengan analisis Probit. Dibandingkan dengan tepung biji lainnya, larva kurang sensitif terhadap perlakuan tepung biji DFP dan memiliki nilai LC50 yang secara statistik lebih tinggi (Tabel 2 dan 3). Setelah 72 jam, nilai LC50 untuk perlakuan tepung biji DFP, IG, dan PG diperkirakan masing-masing sebesar 0,111, 0,085, dan 0,05 g/120 ml dH2O. Setelah 72 jam evaluasi, nilai LC90 dari bubuk biji DFP, IG, dan PG masing-masing adalah 0,215, 0,254, dan 0,138 g/120 ml dH2O. Setelah 72 jam evaluasi, rata-rata mortalitas larva untuk perlakuan tepung biji DFP, IG, dan PG pada konsentrasi maksimum 0,12 g/120 ml dH2O masing-masing adalah 58%, 66%, dan 96% (Gambar 1B). Setelah 72 jam evaluasi, tepung biji PG ditemukan lebih toksik daripada tepung biji IG dan DFP.
Isotiosianat sintetis, alil isotiosianat (AITC), benzil isotiosianat (BITC), dan 4-hidroksibenzilisotiosianat (4-HBITC) dapat secara efektif membunuh larva nyamuk. Pada 24 jam pasca-perlakuan, BITC lebih toksik terhadap larva dengan nilai LC50 sebesar 5,29 ppm dibandingkan dengan 19,35 ppm untuk AITC dan 55,41 ppm untuk 4-HBITC (Tabel 4). Dibandingkan dengan AITC dan BITC, 4-HBITC memiliki toksisitas yang lebih rendah dan nilai LC50 yang lebih tinggi. Terdapat perbedaan signifikan dalam toksisitas larva nyamuk dari dua isotiosianat utama (Ls dan PG) dalam tepung biji yang paling ampuh. Toksisitas berdasarkan rasio dosis letal nilai LC50 antara AITC, BITC, dan 4-HBITC menunjukkan perbedaan statistik sedemikian rupa sehingga 95% CI dari rasio dosis letal LC50 tidak mencakup nilai 1 (P = 0,05, Tabel 4). Konsentrasi tertinggi BITC dan AITC diperkirakan membunuh 100% larva yang diuji (Gambar 2).
Kurva mortalitas diperkirakan dari respons dosis (Probit) Ae. 24 jam setelah perlakuan, larva Mesir (larva instar ke-3) mencapai konsentrasi isotiosianat sintetis. Garis putus-putus mewakili LC50 untuk perlakuan isotiosianat. Benzil isotiosianat BITC, alil isotiosianat AITC dan 4-HBITC.
Penggunaan biopestisida tanaman sebagai agen pengendali vektor nyamuk telah lama dipelajari. Banyak tanaman menghasilkan bahan kimia alami yang memiliki aktivitas insektisida37. Senyawa bioaktifnya memberikan alternatif yang menarik bagi insektisida sintetis dengan potensi besar dalam mengendalikan hama, termasuk nyamuk.
Tanaman sawi ditanam sebagai tanaman pangan untuk bijinya, digunakan sebagai bumbu dan sumber minyak. Ketika minyak sawi diekstrak dari bijinya atau ketika sawi diekstrak untuk digunakan sebagai biofuel, 69 produk sampingannya adalah tepung biji yang telah dihilangkan lemaknya. Tepung biji ini mempertahankan banyak komponen biokimia alami dan enzim hidrolitiknya. Toksisitas tepung biji ini disebabkan oleh produksi isotiosianat55,60,61. Isotiosianat terbentuk melalui hidrolisis glukosinolat oleh enzim myrosinase selama hidrasi tepung biji38,55,70 dan diketahui memiliki efek fungisida, bakterisida, nematisida, dan insektisida, serta sifat-sifat lain termasuk efek sensorik kimia dan sifat kemoterapi61,62,70. Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa tanaman sawi dan tepung bijinya bertindak efektif sebagai fumigan terhadap hama tanah dan hama makanan yang disimpan57,59,71,72. Dalam penelitian ini, kami menilai toksisitas tepung biji-bijian dan tiga produk bioaktifnya, yaitu AITC, BITC, dan 4-HBITC, terhadap larva nyamuk Aedes aegypti. Penambahan tepung biji-bijian langsung ke air yang mengandung larva nyamuk diharapkan dapat mengaktifkan proses enzimatik yang menghasilkan isotiosianat yang beracun bagi larva nyamuk. Biotransformasi ini sebagian ditunjukkan oleh aktivitas larvasida tepung biji-bijian yang diamati dan hilangnya aktivitas insektisida ketika tepung biji sawi kerdil dipanaskan sebelum digunakan. Perlakuan panas diharapkan dapat menghancurkan enzim hidrolitik yang mengaktifkan glukosinolat, sehingga mencegah pembentukan isotiosianat bioaktif. Ini adalah penelitian pertama yang mengkonfirmasi sifat insektisida bubuk biji kubis terhadap nyamuk di lingkungan perairan.
Di antara bubuk biji yang diuji, bubuk biji selada air (Ls) adalah yang paling beracun, menyebabkan kematian tinggi pada Aedes albopictus. Larva Aedes aegypti diproses terus menerus selama 24 jam. Tiga bubuk biji lainnya (PG, IG, dan DFP) memiliki aktivitas yang lebih lambat dan masih menyebabkan kematian yang signifikan setelah 72 jam perlakuan terus menerus. Hanya tepung biji Ls yang mengandung sejumlah besar glukosinolat, sedangkan PG dan DFP mengandung myrosinase dan IG mengandung glukosinolat sebagai glukosinolat utama (Tabel 1). Glukotropaeolin dihidrolisis menjadi BITC dan sinalbin dihidrolisis menjadi 4-HBITC61,62. Hasil bioassay kami menunjukkan bahwa tepung biji Ls dan BITC sintetis sangat beracun bagi larva nyamuk. Komponen utama tepung biji PG dan DFP adalah glukosinolat myrosinase, yang dihidrolisis menjadi AITC. AITC efektif membunuh larva nyamuk dengan nilai LC50 sebesar 19,35 ppm. Dibandingkan dengan AITC dan BITC, 4-HBITC isothiocyanate adalah yang paling tidak beracun bagi larva. Meskipun AITC kurang beracun daripada BITC, nilai LC50-nya lebih rendah daripada banyak minyak esensial yang diuji pada larva nyamuk32,73,74,75.
Bubuk biji cruciferous kami untuk digunakan melawan larva nyamuk mengandung satu glukosinolat utama, yang mencakup lebih dari 98-99% dari total glukosinolat sebagaimana ditentukan oleh HPLC. Sejumlah kecil glukosinolat lain terdeteksi, tetapi kadarnya kurang dari 0,3% dari total glukosinolat. Bubuk biji selada air (L. sativum) mengandung glukosinolat sekunder (sinigrin), tetapi proporsinya adalah 1% dari total glukosinolat, dan kandungannya masih tidak signifikan (sekitar 0,4 mg/g bubuk biji). Meskipun PG dan DFP mengandung glukosinolat utama yang sama (mirosin), aktivitas larvasida dari tepung bijinya berbeda secara signifikan karena nilai LC50-nya. Toksisitas terhadap embun tepung bervariasi. Kemunculan larva Aedes aegypti mungkin disebabkan oleh perbedaan aktivitas atau stabilitas mirosinase antara kedua pakan biji tersebut. Aktivitas myrosinase memainkan peran penting dalam ketersediaan hayati produk hidrolisis seperti isotiosianat pada tanaman Brassicaceae76. Laporan sebelumnya oleh Pocock et al.77 dan Wilkinson et al.78 telah menunjukkan bahwa perubahan aktivitas dan stabilitas myrosinase juga dapat dikaitkan dengan faktor genetik dan lingkungan.
Kandungan isotiosianat bioaktif yang diharapkan dihitung berdasarkan nilai LC50 dari setiap tepung biji pada 24 dan 72 jam (Tabel 5) untuk perbandingan dengan aplikasi kimia yang sesuai. Setelah 24 jam, isotiosianat dalam tepung biji lebih beracun daripada senyawa murni. Nilai LC50 yang dihitung berdasarkan bagian per juta (ppm) dari perlakuan biji isotiosianat lebih rendah daripada nilai LC50 untuk aplikasi BITC, AITC, dan 4-HBITC. Kami mengamati larva mengonsumsi pelet tepung biji (Gambar 3A). Akibatnya, larva mungkin menerima paparan isotiosianat beracun yang lebih terkonsentrasi dengan menelan pelet tepung biji. Hal ini paling jelas terlihat pada perlakuan tepung biji IG dan PG pada paparan 24 jam, di mana konsentrasi LC50 masing-masing 75% dan 72% lebih rendah daripada perlakuan AITC dan 4-HBITC murni. Perlakuan Ls dan DFP lebih toksik daripada isothiocyanate murni, dengan nilai LC50 masing-masing 24% dan 41% lebih rendah. Larva pada perlakuan kontrol berhasil menjadi pupa (Gambar 3B), sedangkan sebagian besar larva pada perlakuan tepung biji tidak menjadi pupa dan perkembangan larva tertunda secara signifikan (Gambar 3B,D). Pada Spodopteralitura, isothiocyanate dikaitkan dengan perlambatan pertumbuhan dan keterlambatan perkembangan79.
Larva nyamuk Ae. Aedes aegypti terus-menerus terpapar bubuk biji Brassica selama 24–72 jam. (A) Larva mati dengan partikel tepung biji di bagian mulut (dilingkari); (B) Perlakuan kontrol (dH2O tanpa tambahan tepung biji) menunjukkan bahwa larva tumbuh normal dan mulai menjadi pupa setelah 72 jam (C, D) Larva yang diberi perlakuan tepung biji; tepung biji menunjukkan perbedaan dalam perkembangan dan tidak menjadi pupa.
Kami belum mempelajari mekanisme efek toksik isothiocyanate pada larva nyamuk. Namun, penelitian sebelumnya pada semut api merah (Solenopsis invicta) telah menunjukkan bahwa penghambatan glutathione S-transferase (GST) dan esterase (EST) adalah mekanisme utama bioaktivitas isothiocyanate, dan AITC, bahkan pada aktivitas rendah, juga dapat menghambat aktivitas GST pada semut api merah impor pada konsentrasi rendah. Dosisnya adalah 0,5 µg/ml80. Sebaliknya, AITC menghambat asetilkolinesterase pada kumbang jagung dewasa (Sitophilus zeamais)81. Studi serupa harus dilakukan untuk menjelaskan mekanisme aktivitas isothiocyanate pada larva nyamuk.
Kami menggunakan perlakuan DFP yang dinonaktifkan dengan panas untuk mendukung usulan bahwa hidrolisis glukosinolat tanaman untuk membentuk isotiosianat reaktif berfungsi sebagai mekanisme pengendalian larva nyamuk oleh tepung biji sawi. Tepung biji DFP-HT tidak beracun pada tingkat aplikasi yang diuji. Lafarga dkk. 82 melaporkan bahwa glukosinolat sensitif terhadap degradasi pada suhu tinggi. Perlakuan panas juga diharapkan dapat mendenaturasi enzim myrosinase dalam tepung biji dan mencegah hidrolisis glukosinolat untuk membentuk isotiosianat reaktif. Hal ini juga dikonfirmasi oleh Okunade dkk. 75 yang menunjukkan bahwa myrosinase sensitif terhadap suhu, menunjukkan bahwa aktivitas myrosinase sepenuhnya dinonaktifkan ketika biji sawi, sawi hitam, dan bloodroot terpapar suhu di atas 80°C. Mekanisme ini dapat mengakibatkan hilangnya aktivitas insektisida dari tepung biji DFP yang diberi perlakuan panas.
Dengan demikian, tepung biji sawi dan tiga isotiosianat utamanya bersifat toksik terhadap larva nyamuk. Mengingat perbedaan antara tepung biji dan perlakuan kimia, penggunaan tepung biji mungkin merupakan metode pengendalian nyamuk yang efektif. Diperlukan identifikasi formulasi yang sesuai dan sistem pengiriman yang efektif untuk meningkatkan efikasi dan stabilitas penggunaan bubuk biji. Hasil kami menunjukkan potensi penggunaan tepung biji sawi sebagai alternatif pestisida sintetis. Teknologi ini dapat menjadi alat inovatif untuk mengendalikan vektor nyamuk. Karena larva nyamuk berkembang biak di lingkungan perairan dan glukosinolat tepung biji diubah secara enzimatik menjadi isotiosianat aktif setelah hidrasi, penggunaan tepung biji sawi di perairan yang dipenuhi nyamuk menawarkan potensi pengendalian yang signifikan. Meskipun aktivitas larvasida isotiosianat bervariasi (BITC > AITC > 4-HBITC), penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menentukan apakah penggabungan tepung biji dengan beberapa glukosinolat secara sinergis meningkatkan toksisitas. Ini adalah studi pertama yang menunjukkan efek insektisida dari tepung biji tanaman cruciferous yang telah dihilangkan lemaknya dan tiga isothiocyanat bioaktif terhadap nyamuk. Hasil studi ini membuka babak baru dengan menunjukkan bahwa tepung biji kubis yang telah dihilangkan lemaknya, produk sampingan dari ekstraksi minyak dari bijinya, dapat berfungsi sebagai agen larvasida yang menjanjikan untuk pengendalian nyamuk. Informasi ini dapat membantu penemuan lebih lanjut agen biokontrol tanaman dan pengembangannya sebagai biopestisida yang murah, praktis, dan ramah lingkungan.
Kumpulan data yang dihasilkan untuk penelitian ini dan analisis yang dihasilkan tersedia dari penulis terkait atas permintaan yang wajar. Pada akhir penelitian, semua bahan yang digunakan dalam penelitian (serangga dan tepung biji) dimusnahkan.
Waktu posting: 29 Juli 2024